生物合成材料聚β－羥基丁酸ＰＨＢ的研究進展

生物合成材料聚β－羥基丁酸（ＰＨＢ）的研究進展

　　摘要:聚β-羥基丁酸(PHB)是許多原核微生物在碳、氮營養失衡的情況下作為能量和碳源儲藏在生物體內的一類熱塑性聚酯。作為完全可生物降解材料,PHB越來越引起人們的關注。有力文章主要闡述了國內外PHB合成方法、性能改良、降解等方面的進展,并對其發展前景作出展望。
　　關鍵詞:PHB;生物降解材料;生物合成;改良;降解

　　隨著石油化學工業的發展,化學合成塑料的使用越來越廣泛,作為合成高分子材料,化學合成塑料在自然環境下難以分解,造成了嚴重的“白色污染”。過去對廢舊塑料的處理辦法主要是土埋和焚燒,土埋浪費大量的土地,焚燒則會產生大量的二氧化碳及其它對人有害的氮、硫、磷、鹵素等化合物,助長了溫室效應及酸雨的形成。面對日益嚴峻的資源和環境問題,走可持續發展道路,就要研究開發可自然降解的新材料。PHB是微生物合成型降解材料中的典型代表,具有良好的生物降解性,分解產物可全部為生物利用,目前研究較為深入并初步進入商品化階段。
　　1PHB的性質
　　
　　聚羥基丁酸酯PHB,作為一種天然高分子聚合物,具有生物相容性、生物可降解性、無刺激性、無免疫原性和組織相容性等特殊性能,在組織工程、藥物緩釋控釋系統、骨科以及醫用手術縫合線領域獲得成功的應用。PHB有良好的生物降解性,其分解產物可全部為生物利用,對環境無任何污染;其熔融溫度為175～180℃,是一種可完全分解的熱塑性塑料。它的物理性質和分子結構與聚丙烯(PP)很類似,如摩爾質量、軟化點、結晶度、拉伸強度等,目前主要應用于醫療、工業、包裝、農業等領域。
　　
　　2PHB的生物合成
　　
　　PHB的生物合成途徑有微生物發酵法,轉基因植物法。
　　2.1微生物發酵
　　微生物發酵生產是獲得生物可降解塑料的主要途徑,近30年大量的研究工作集中于發酵工藝的改進和高效菌株的篩選來提高PHA的容積產率和胞內含量。最近利用污水處理系統中的活性污泥合成PHB,大大降低了底物成本且無需滅菌操作,大大降低了成本,吸引了廣泛的關注。
　　2.1.1細菌發酵合成PHB工藝改良
　　到目前為止,已發現100種以上的細菌能夠生產PHB。通常,在自然環境中微生物能儲備干燥菌體質量5%～20%的PHB。在合適的條件,如碳源過量、限制氮、磷等發酵條件下,PHB含量可以達到細胞干重的70%～80%自然界中許多屬、種的細菌在細胞內都能積累PHB顆粒,如產堿桿菌、甲基營養菌及鞘細菌等。于平、勵建榮等在相關研究文獻[1]中指出真養產堿桿菌發酵生產聚β-羥基丁酸(PHB)的最優化培養基組成和培養條件為:葡萄糖4.0%,硫酸銨0.3%,pH7.2,裝液量80mL/250mL,接種量10%,PHB的質量濃度達到最高值0.825g/L,細胞干重為1.734g/L。鞘細菌對環境的適應能力較強,且有研究表明,其細胞內的PHB貯存比例較高。全桂靜和程文輝[2]通過實驗表明:以甘油和蛋白胨為碳源和氮源,適宜條件下100mL發酵液的PHB產量最高可達10.58mg。
　　2.1.2篩選高效菌種
　　國內外對于高效菌種的選育主要有構建基因工程菌法和紫外線誘變法。1987年,吉利亞James Madison大學的Dennis成功地從A.eutrophus中克隆到合成PHB的基因,并轉入E.coil中構建成重組E.coil突變株,其細胞比正常細菌細胞大10倍,該菌株可以直接利用各種碳源,如葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖等廉價底物,進一步降低了成本。奧地利維也納大學在組建工程大腸桿菌的同時引入熱敏噬菌體溶解基因,可使細菌易裂解釋放PHB,這一成果的最大特點是可降低提取成本,為推向市場打下基礎。在國內也有一些紫外誘變法篩選優良菌株的研究,使原始菌株PHB產量得到很大的提高,如國家重點基礎研究發展計劃項目中徐愛玲、張帥等采用紫外線照射和放射性元素鈷60輻射誘變方法,對Acidiphilium cryptum DX1-1進行了誘變改良,誘變后篩選得到的一株菌UV60-3,PHB含量達到28.56g/L,是原菌株的1.45倍,并且可穩定遺傳。對菌株UV60-3積累PHB的碳氮比進行了探索,結果顯示在碳源濃度60g/L,氮源濃度30 g/L,C/N為3.76時PHB含量最高,PHB含量達到30.57g/L。[3]
　　2.1.3活性污泥合成PHB
　　利用活性污泥的混合碳源與微生物群合成PHB 是生物合成PHB 的一條新途徑,既處理了污水,又降低了合成費用,而且得到的產物其性能比單一菌株在純碳源培養得到的PHB要優越。在污水處理過程中,活性污泥微生物常常將可快速降解的碳源物質貯存為PHA,而不是首先將它們用于生物量的增長,因此,可以通過適當的工藝調控將活性污泥馴化為PHA的生產者。日本東京大學的Satoh.H. 研究小組發現采用“微嗜氣2好氣”供氣過程可以提高PHB在污泥中的產量,[4、5]表明了工藝過程、營養組成及條件控制影響PHAs的產率。中國科學院生態環境研究中心曲波、劉俊新在活性污泥合成可生物降解塑料PHB的工藝優化研究中結果中表明——溶解氧(DO)濃度、pH值和底物-生物量比(food-microorganism ratio,F/M)是對PHB生產影響的關鍵參數底物的吸收速率、PHB產率和胞內含量均隨溶解氧濃度的提高而提高,本研究最優操作條件下獲得的PHB 含量已經接近純培養方法所獲得的典型的PHB 含量,展現了活性污泥合成PHB 的應用前景。[6]
　　2.2轉基因植物法
　　由于PHB的高成本生產和生物技術的進步,人們開始將注意力轉移到用轉基因植物來生產PHB,1992年,Poirier首先探討了用植物生產PHB的可行性,在擬南芥細胞質中定向合成PHB但是擬南芥的生長卻受到抑制,把細菌PHB生物合成的途徑定位于質體中,PHB占葉子干重的40%,但發現了植物生長和PHB含量有負關系。John等對用轉基因棉花合成PHB做了嘗試。轉基因棉花纖維的長度,強度都正常,但其絕緣性能卻提高了。熱性能改變很小,可能是因為只有很少量的PHB在纖維細胞的細胞質中(占纖維重的0.34%)[7]王潮崗、胡章立以萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)作為受體材料,將合成的相關酶基因phbB和phbC導入衣藻中,實現了PHB在胞質中的合成,但含量較少。
　　
　　3PHB性能的改良
　　
　　PHB是一種全同立構結晶性的聚酯,結晶度高達80%,常溫及玻璃化溫度(4℃)下表現為脆性,耐沖擊性能較差;加工成型只能在190℃附近的一個狹窄的溫度區間內進行,且熔融狀態極不穩定,易發生降解。這些缺點使其無法作為一種實用的塑料使用,同時也限制了在降解材料方面的應用。PHB改性主要體現在增韌和增塑改性,PHB增韌主要通過彈力體、聚乙二醇(PEO)、淀粉等與之共混改性,文獻報道的有效增塑劑有低相對分子質量PEO、檸檬酸三丁(三乙)酯、三乙酸(丁酸)甘油酯、ESO等從改良途徑講主要有物理共混、化學改性、生物改性。
　　
　　4PHB的降解
　　
　　PHB的生物降解歸因于許多細菌和真菌能夠分泌胞外PHB解聚酶PHB在解聚酶的作用下得到3-羥基丁酸,經過三羥基丁酸脫氫酶、乙酰乙酰輔酶和β-酮硫解酶作用下依次得到三羥基丁酸、乙酰乙酰輔酶A、乙酰輔酶A最后進入TCA循環。

　　國外從60年代陸續開展了有關降解PHB的工作,但絕大部分菌株是近些年來獲得的。1963年Chowdhury首次發現降解PHB的微生物,它們是Bacillus,Seudomonas和Streptomyces,隨后人們陸續動環境中分離出其他一些能降解PHB的微生物類型。直接用從自然界中篩選的菌種產生的PHB降解酶的活性比較低,降解PHB的速度比較緩慢。近幾年有許多學者通過紫外線誘變獲得了高產PHB的菌株。次素琴、陳珊等以降解聚2β羥基丁酸酯(PHB)的青霉(Penicillium sp1)DS9713a為出發菌株,通過紫外線(UV)誘變分生孢子,采用透明圈初篩和搖瓶復篩,獲得酶活高于原始菌株的突變株5株,其中DS9713a-CS01突變株的PHB解聚酶活力高于對照97.42%。[8]中國科學院研究所戴美學等根據苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)Rm1021基因組中與Ralstonia eutropha phaZ基因同源部分序列設計1對引物,從S.meliloti基因組中用PCR擴增出835bp phbD基因片段并克隆到載體PGEM○R-T Easy上;通過在phbD 基因內插入ΩSmSp和基因置換構建了phbD突變體。該突變體可積累比野生型菌株多1.0～2.6倍的聚羥丁酶。[9]
　　
　　5展 望
　　
　　PHB作為最具代表性的一類生物塑料,具有良好的生物相容性和生物降解性。但是由于其生產菌的產量不高,生產菌在生長過程中所消耗的原料價格較高,天然產物的機械性能差,很多降解菌不能降解胞外的PHB等缺點影響了其使用,近年來,有大量的學者對此進行研究并取得了很大的進展。在能源與經濟、環保相協調的今天,隨著科技的進步,人們環保意識的增強,PHB將就有廣闊的前景。
　　
　　參考文獻
　　1 于 平、勵建榮.真養產堿桿菌發酵生產PHB的培養條件優化[J].中國食品學報,2007.1:61～63
　　2 全桂靜、程文輝.鞘細菌液體發酵生產PHB的研究[J].沈陽化工學院學報,2008.22(4):312～315
　　3 徐愛玲、張 帥等.積累PHB菌種隱藏嗜酸菌DX1-1的誘變改良[J].微生物學通報,2008.35(10):1516～1521
　　4 Satoh H, Iwamoto Y, Matsuo T.PHA production by acti2vated sludge[J].International Journal of Biological Macro2molecules, 1999. 25(1～3): 1052109
　　5 Satoh H, Iwamoto Y, Matsuo T.Activated sludge as a pos2 sible source of biodegradable plastic [J].Wat. Sci. Tech, 1998. 38(2): 1032109
　　6 曲 波、劉俊新.活性污泥合成可生物降解塑料PHB的工藝優化研究[J].科學通報,2008.53.13:1598～1604
　　7 王述彬、刑偵琦等.用基因植物生產生物可降解塑料的研究進展[J].研究與進展,2005.5:33～35
　　8 次素琴、陳 珊等.紫外線誘變選育高產PHB解聚酶的菌株[J].微生物學通報,2005.32:38～43
　　9 戴美學、武 波等.苜蓿根瘤菌聚羥丁酸解聚酶基因JK3LM,N突變體的構建及其特性[J].農業生物技術學報,2003.11:115～120

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