論p120ctn 亞型肺癌免疫熒光表達及意義

論p120ctn 亞型肺癌免疫熒光表達及意義

作為連環素家族的新成員，在細胞黏附和信號轉導中起著至關重要的作用 [1-4]。
　　它的基因有21 個外顯子，根據其剪切的不同，理論上p120ctn 可產生32 個亞型，所有的亞型都具有相同的犰狳(Armadillo)重復序列，只是C 端或N 端不同[5]。根據其起始翻譯密碼的不同人類的p120ctn 可分為4 種亞型，但各亞型的生物學功能至今尚未闡明[6,7]。目前在人肺癌中的研究很少，其在肺癌中表達的亞型種類及表達情況仍不清楚。本研究采用免疫熒光和Western Blot 方法，觀察了p120ctn 及其各亞型在肺鱗癌、腺癌中的表達及意義，并探討其與肺癌的臨床病理因素的關系。
　　材料與方法材料例原發性肺癌及對應癌旁正常肺組織來自2003 年11 月至2004 年9 月在中國醫科大學第一附屬醫院行外科手術切除的新鮮標本。 患者術前均未接受過放化療。標本取出后立即放入-70℃冰箱保存備用。其中男37 例，女13 例，平均年齡59 歲（32-78 歲）。按年WHO 肺腫瘤組織學分類標準[8]，鱗癌15 例，腺癌35 例；高分化12 例，中分化23 例，低分化15 例；有淋巴結轉移22 例，無淋巴結轉移28 例。依據國際抗癌聯盟(UICC)1999 年修訂的肺癌p-TNM 分期標準[9] ：Ⅰ期13 例，Ⅱ期10 例，Ⅲ期27 例。
　　方法冰凍組織切片和免疫熒光染色觀察取新鮮肺癌和癌旁正常肺組織標本 OCT 包埋，快速冷凍后制成5μm 厚的切片，貼附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，冷丙酮固定10min 后晾干備用。
　　固定后的冰凍組織切片用0.2% Triton X-100 處理15min。正常非免疫動物血清37℃孵育30min。滴加p120ctn 鼠抗人單克隆抗體（1:400，BD Transduction Laboratories），4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，每次5min，重復三次。滴加羅丹明標記羊抗鼠熒光標記二抗（1:200，北京中杉），37℃孵育30 分鐘。PBS 沖洗，每次5min，重復三次。DAPI (1:200，SIGMA 公司)核復染30min；PBS 沖洗；50%甘油封片，熒光顯微鏡于波長為527nm 處觀察羅丹明熒光強度,于372nm 波長處觀察DAPI 的熒光染色,確定p120ctn 的表達及定位。
　　從新鮮肺癌和癌旁正常肺組織標本中取0.125cm3 左右大小的組織塊，加入500μL 裂解液中冰浴下勻漿，4℃靜置24h，低溫高速離心（4℃、13000 轉/分、30min），收集上清。中國碩士論文網為您提供公共管理碩士論文。
　　用考馬斯亮蘭法，以牛血清蛋白作為標準進行蛋白定量，計算各樣品蛋白濃度。
　　將含 50μg 總蛋白的組織裂解產物進行SDS-PAGE 電泳1.5h 后，轉印至PVDF 膜（100V，），5%脫脂奶粉室溫封閉1h，經TTBS（20mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，）沖洗3 次，抗p120ctn 單克隆抗體（1：400，BD Transduction Laboratories）4℃孵育過夜后，辣根過氧化物酶標記二抗37℃孵育1h，TTBS 洗三次后DAB 顯色。以β為內對照，用凝膠成像分析系統（Biolmaging Systems,美國）測定p120ctn 各條帶灰度值，并取其與β-actin 的比值為相對表達量分析p120ctn 各亞型的表達情況。
　　統計分析利用 SPSS for Window 11.5 進行統計分析。p120ctn 及其亞型在正常支氣管上皮和癌中表達的關系采用Wilcoxon 符號檢驗, p120ctn 及其亞型表達與臨床病理因素的關系采用秩相關檢驗，P＜0.05 有統計學意義。
　　結果免疫熒光結果在癌旁正常肺組織中的支氣管上皮細胞胞膜上強表達，呈現完整、連續的紅色強熒光，而在肺癌細胞中p120ctn 的膜熒光表達明顯減弱，呈現不連續或缺失，并可出現胞漿表達（圖1）。
　　結果參照預染蛋白分子量標準（賽百盛，北京，中國），在癌旁正常肺組織可見100KDa 和附近有特異性的條帶，對應位置相當于p120ctn 的亞型1(120KDa)和3(100KDa)，而在肺癌組織中亞型1 和3（尤其是亞型1）多表現為缺失或減弱（圖2）。
　　對Western Blot 圖像結果的分析表明，包括1 和3 亞型在內的p120ctn 總蛋白在癌旁正常肺組織中的表達明顯高于肺癌組織(P＜0.001，n=50)。p120ctn 的亞型1 和亞型3 在癌組織中的表達均有不同程度的缺失或減弱（P=0.001，n=50；P＜0.001，n=50)。亞型1 的缺失與各臨床病理因素無關,而亞型3 的表達缺失與淋巴結轉移呈負相關（P=0.005，n=50，r=0.397），與其他臨床病理因素無關（表1）。
　　討論我們以往的研究 [10-12]顯示p120ctn 在正常肺組織中，主要以細胞膜表達為主，而在肺癌組織中則出現細胞膜表達下降，并伴有細胞漿或細胞核表達。我們應用免疫熒光法觀察其在組織冰凍切片中的表達，其結果與我們以往的研究和在其它腫瘤中的報道[13-17]相似。在正常的肺組織中，p120ctn 于胞漿近胞膜域參與上皮鈣黏素（E-cadherin）復合體的組成，進而穩定細胞間的黏附，因而我們觀察到p120ctn 在細胞膜上呈完整、連續的較強的紅色熒光；而在肺癌組織中，p120ctn 的膜表達減弱，出現熒光的不連續或缺失。這可能是由于腫瘤細胞中的p120ctn 從E-cadherin 復合體中解離出來的結果，這一結果可破壞細胞間的黏附功能，從而利于腫瘤細胞的侵襲和轉移。脫離了復合體的p120ctn 可轉向胞漿內，所以我們可以在細胞漿內可以檢測到它的蓄積。
　　目前，p120ctn 在細胞黏附過程中的確切作用機制存在著很大爭議[18,19]，其中原因之一就是由于p120ctn 具有多種亞型的存在，并且這些亞型的表達具有組織特異性[19-21]。
　　理論上，根據剪切不同，人類的p120ctn 可以產生32 種亞型，而且在不同的組織和細胞類型中p120ctn 亞型的剪切方式是不同的。根據起始翻譯密碼ATG 在N-端的不同位置，可分為亞型1-4，根據外顯子A、B、C 在C-端不同應用又可將這四種亞型分為多種次亞型。
　　由于這些剪切方式只影響到N-端和C-端，其間的犰狳重復序列并未受到干擾，因而，它可以保持完整結構從而與E-cadherin 相連[18,19]。通過這種結合方式，p120ctn 的各種亞型都可以與E-cadherin 結合，進而對E-cadherin 復合體介導的細胞黏附進行調節。但關于p120ctn 各亞型的具體生物學功能及確切作用機制至今仍不清楚。盡管在人類正常組織中，可檢測到四種p120ctn 亞型[20]，但我們檢測了癌旁正常肺組織后發現，只在120KD 和100KD 處檢測到兩條特異性的條帶，對應其位置相當于p120ctn 的1、3 兩種亞型，并沒有檢測到明確的和4 亞型的表達。這一結果提示，p120ctn 亞型1 和亞型3 在肺組織內有較好的特異性表達。
　　與癌旁正常肺組織相比，肺癌組織中p120ctn 總蛋白的表達量明顯減少，這與Skoudy 等人在結直腸癌中研究的結果類似。但是，p120ctn 總蛋白的表達與肺癌組織的分期、分化等臨床病理因素并無任何相關性。為了深入探究p120ctn 在肺癌組織中的亞型表達及其意義。我們分別對p120ctn 亞型1、3 的表達量進行統計分析，結果表明：肺癌組織中亞型1 的表達量明顯低于它在癌旁正常肺組織中的表達量，但是，我們沒有檢測到它的表達與各臨床病理因素相關。亞型3 在癌組織中表達也明顯低于正常肺組織，與亞型1 不同的是,亞型3 的減少沒有亞型1 明顯，而且它的表達缺失與淋巴結轉移呈負相關，與其它各臨床病理因素無關。從結果我們可以得出這樣的推論：p120ctn 亞型1 與亞型3 可能是肺組織中主要表達的亞型，它們的表達可能與肺癌細胞的惡性程度有關，而且，這兩種亞型對癌細胞惡性表型的影響可能也是不同的。從統計結果可以看出：在分化程度較好，無淋巴結轉移的癌組織中，亞型3 的缺失較多。也就是說，亞型3 很可能會有促進癌細胞向惡性表型轉化的作用，而亞型1 的作用并不明顯。
　　從我們的實驗結果可以看出，在癌旁正常肺組織中p120ctn 主要以亞型1 和亞型3 的表達為主，在肺癌組織中這兩種亞型可以出現不同程度的缺失或減弱。并且它們各自的缺失程度可能對癌細胞的惡性表型有不同的影響：亞型1 的表達缺失可能會促進癌細胞的惡性表型，而亞型3 的表達缺失很可能會抑制癌細胞的惡性表型。那么在肺癌組織中，p120ctn 漿表達是否與亞型3 的表達具有一致性呢？亞型1 和3 的表達在影響癌細胞惡性表型方面究竟怎樣發揮各自的生物學功能呢？這些還需要我們去做更深層的研討。

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