微生物檢驗(yàn)必須掌握的三大耐藥機(jī)制
你知道什么是微生物檢驗(yàn)嗎?你對(duì)微生物檢驗(yàn)了解嗎?下面是yjbys小編為大家?guī)淼年P(guān)于微生物檢驗(yàn)必須要知道的三大耐藥機(jī)制的知識(shí)，歡迎閱讀。
一、產(chǎn)生滅活抗生素的各種酶
1、 β—內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)
β—內(nèi)酰胺類抗生素都共同具有一個(gè)核心β—內(nèi)酰胺環(huán)，其基本作用機(jī)制是與細(xì)菌的青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。產(chǎn)生β—內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因。細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶，可借助其分子中的絲氨酸活性位點(diǎn)，與β—內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)合并打開β—內(nèi)酰胺環(huán)，導(dǎo)致藥物失活。迄今為止報(bào)道的β—內(nèi)酰胺酶已超過300種，1995年Bush等將其分為四型：第1型為不被克拉維酸抑制的頭孢菌素酶;第2型為能被克拉維酸抑制的β-內(nèi)酰胺酶;第3型為不被所有β—內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制的金屬β-內(nèi)酰胺酶(需Zn2+活化)�？杀灰叶匪囊宜岷蚉-chloromercuribenzate所抑制;第4型為不被克拉維酸抑制的青霉素酶。臨床常見的β—內(nèi)酰胺酶有超廣譜β—內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶(AmpC酶)和金屬酶。
(1)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-Spectrumβ-lactamases,ESBLs)
ESBLs是一類能夠水解青霉素類、頭孢菌素類及單環(huán)類抗生素的β—內(nèi)酰胺酶，屬Bush分型中的2型β—內(nèi)酰胺酶，其活性能被某些β—內(nèi)酰胺酶抑制劑(棒酸、舒巴坦、他唑巴坦)所抑制。ESBLs主要由普通β-內(nèi)酰胺酶基因(TEM—1，TEM—2和SHV—1等)突變而來，其耐藥性多由質(zhì)粒介導(dǎo)。自1983年在德國首次發(fā)現(xiàn)ESBLs以來，目前已報(bào)道的TEM類ESBIs已有90多種，SHV類ESBLs多于25種。TEM型和SHV型ESBLs主要發(fā)現(xiàn)于肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，亦發(fā)現(xiàn)于變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬和其他腸桿菌科細(xì)菌。
國內(nèi)近年來隨著三代頭孢菌素的廣泛使用，產(chǎn)ESBLs菌的檢出率逐年增加。NCCLs規(guī)定，凡臨床分離的大腸埃希氏菌和克雷伯氏菌均應(yīng)監(jiān)測是否為產(chǎn)ESBLs菌株;若產(chǎn)生，無論體外對(duì)第三代頭抱菌素、氨曲南的藥敏結(jié)果如何，均應(yīng)報(bào)告對(duì)三代頭孢菌素及氨曲南耐藥。另外，ESBLs菌株不僅對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素有很高的耐藥率，而且對(duì)氨基糖苷類、喹喏酮類耐藥率也在60%左右，因此，臨床遇到由ESBLs引起的感染時(shí)，建議首選含β—內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)方抗生素制劑或亞胺培南;對(duì)于頭孢吡肟等四代頭孢，尚有爭議，根據(jù)抗菌藥的PK/PD理論，適當(dāng)改變給藥劑量和給藥間隔。以使血藥濃度超過細(xì)菌MIC的時(shí)間達(dá)40%給藥間隔以上，或許是有效的。
(2)頭孢菌素酶(AmpC酶)屆Bush分類中的1型(Ⅰ型) β—內(nèi)酰胺酶。
通常將其分為由染色體介導(dǎo)產(chǎn)生的AmpC β—內(nèi)酰胺酶和由質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的AmpC β—內(nèi)酰胺酶，前者的產(chǎn)生菌有陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌等，后者主要由肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌產(chǎn)生。AmpC酶可作用于大多數(shù)青霉素，第一、二、三代頭孢菌素和單環(huán)類抗生素。而第四代頭孢菌素、碳青霉烯類不受該酶作用。該酶不能被β—內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制。AmpCβ—內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生有2種可能：①在誘導(dǎo)劑存在時(shí)暫時(shí)高水平產(chǎn)生，當(dāng)誘導(dǎo)劑不存在時(shí)，酶產(chǎn)量隨之下降，三代頭孢菌素、棒酸和碳青霉烯類抗生素是誘導(dǎo)型AmpC酶的強(qiáng)誘導(dǎo)劑;②染色體上控制酶表達(dá)的基因發(fā)生突變，導(dǎo)致AmpC酶持續(xù)穩(wěn)定高水平表達(dá)。由高產(chǎn)AmpC酶耐藥菌引起的感染死亡率很高。
實(shí)際上，所有的革蘭氏陰性菌都能產(chǎn)生染色體介導(dǎo)的AmpC頭孢菌素酶，在多數(shù)情況下為低水平表達(dá);在腸桿菌、檸檬酸桿菌、沙雷氏菌、銅綠假單胞菌中可高頻誘導(dǎo)產(chǎn)生，且常為高產(chǎn)突變株。當(dāng)臨床出現(xiàn)上述細(xì)菌感染，開始幾天三代頭孢菌素治療敏感，而隨后發(fā)生耐藥時(shí)，我們可懷疑為高產(chǎn)AmpC酶的細(xì)菌感染，四代頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素不受具影響，可供臨床選用。含酶抑制劑的復(fù)方制劑不能用于治療產(chǎn)AmpC酶菌株的感染。
(3)金屬酶(metalloβ-1actamase)
大部分β-內(nèi)酰胺酶的活性位點(diǎn)是絲氨酸殘基，但也有一小部分活性位點(diǎn)為金屬離子的酶類。第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的以金屬離子為活性中心的酶是由蠟樣芽抱桿菌產(chǎn)生的頭孢菌素酶，能被EDTA所抑制，之后世界各地均發(fā)現(xiàn)了能產(chǎn)生這類酶的各種細(xì)菌。1988年Bush首次將該酶定名為金屬β-內(nèi)酰胺酶(metalloβ-1actamase)，簡稱金屬酶。金屬β-內(nèi)酰胺酶耐受β—內(nèi)酰胺酶抑制劑且可水解幾乎所有β—內(nèi)酰胺類抗生素(包括亞胺培南)。該酶已在氣單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌中發(fā)現(xiàn)，其中嗜麥芽窄食單胞菌的亞胺培南耐藥性由染色體介導(dǎo)，而脆弱擬桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的突變株在日本已有報(bào)道。由粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的金屬β—內(nèi)酰胺酶IMP-1型可在類似接合子的intl3上移動(dòng)，已經(jīng)傳播到銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)堿桿菌。金屬酶可以水解碳青霉烯類和最近開發(fā)的第四代頭孢菌素。金屬β-內(nèi)酰胺酶有廣泛傳播的潛力，對(duì)幾乎所有的β—內(nèi)酰胺類抗生素均具有水解活性，是目前所知的最強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺酶-。
2、氨基糖甙修飾酶(或鈍化酶/滅活酶)
在細(xì)菌對(duì)氨基糖甙類抗生素產(chǎn)生耐藥的機(jī)制中，修飾酶介導(dǎo)的耐藥最為流行，酶促修飾的氨基糖甙類抗生素不能與核糖體靶位作用，因此失去抗菌活性。修飾酶主要包括乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和核苷轉(zhuǎn)移酶。三類氨基糖苷修飾酶的作用機(jī)制各不相同：乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)修飾依賴于乙酰輔酶A的N-乙�；毫姿徂D(zhuǎn)移酶(APH)修飾依賴于ATP的O-磷酸化;核苷酸轉(zhuǎn)移酶(ANT)修飾依賴于ATP的腺苷化。在革蘭氏陰性病原菌中，最常見的氨基糖苷修飾酶是AAC(6’)，使氨基糖苷類抗生素1—、3—、2’—或6'—位乙酰化，如今已發(fā)現(xiàn)16種編碼AAC(6’)的基因。銅綠假單胞菌和腸桿菌科細(xì)菌趨向于產(chǎn)生AAC(3)、AAC(6’)、ANT(2’’)以及APH(3’);葡萄球菌和糞腸球菌經(jīng)常產(chǎn)生ANT(4’)(4’’)或雙功能的AAC(6’)/APH(2”)。葡萄球菌對(duì)慶大霉素、卡那霉素和妥布霉素的`耐藥性和腸球菌的高度慶大霉素耐藥性通常由雙功能酶介導(dǎo)，這些酶通常(但非總是)由位于多重耐藥質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)座子(Tn924)編碼，如葡萄球菌具有的轉(zhuǎn)座子Tn5405編碼的APH(3’)(提供卡那霉素、新霉素和阿米卡星耐藥性)，而其他的定位于染色體。越來越多的菌株可產(chǎn)生2種或更多種酶，對(duì)抗氨基糖苷類抗生素。在過去幾年里常見的組合是慶大霉素修飾酶ANT(2’’)和AAC(3)]與AAC(6’)結(jié)合，導(dǎo)致對(duì)慶大霉素、妥布霉素、耐替米星、卡那霉素和阿米卡星的廣譜耐藥性。
氨基糖苷類抗生素對(duì)非發(fā)酵菌、腸桿菌科及一些革蘭氏陽性球菌均有很好的抗菌活性，與β—內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用有協(xié)同抗菌作用，在感染治療中占有重要地位。但由于以上耐藥機(jī)制的存在，細(xì)菌耐藥問題也日趨嚴(yán)重，應(yīng)該引起重視，可喜的是阿米卡星等對(duì)MRSA和產(chǎn)ESBLs菌株仍保持17%-40%的敏感率。
二、改變藥物作用靶位
1、 青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的改變導(dǎo)致的β—內(nèi)酰胺類抗生素耐藥
青霉素結(jié)合蛋白(PBP)參與了肽聚糖合成的最后階段。高分子量PBP常常為多模塊，具有N末端糖基轉(zhuǎn)移酶區(qū)和C末端轉(zhuǎn)肽酶區(qū)。轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的活性位點(diǎn)絲氨酸與酶的天然結(jié)構(gòu)相仿，可與與β—內(nèi)酰胺類抗生素發(fā)生不可逆�；�。青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的改變常導(dǎo)致如下兩種臨床重要的耐藥表型。
(1)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus arueus,MRSA)
MRSA是20世紀(jì)60年代英國首先報(bào)道的一種嚴(yán)重的臨床耐藥致病菌,20世紀(jì)80年代以來，世界各地都相繼發(fā)生MRSA醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，并逐年增多。MRSA耐藥分為固有耐藥和獲得性耐藥，固有耐藥是由染色體介導(dǎo)的，其耐藥性的產(chǎn)生是因?yàn)榧?xì)菌產(chǎn)生一種特殊的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a(或PBP2’)，分子量為78000的蛋白質(zhì)，與β內(nèi)酰胺類抗生素的親和力減低，從而導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。PBP2a由mecA基因編碼，95%以上的MRSA菌株能檢測到mecA基因，而敏感株則無。獲得性耐藥是由質(zhì)粒介導(dǎo)的，細(xì)菌獲得耐藥基因后，產(chǎn)生大量β-內(nèi)酰胺酶(而不是PBPs)，使耐酶青霉素緩慢失活，表現(xiàn)出耐藥性，多為臨界耐藥。
在MRSA檢測過程中，凡屬M(fèi)RSA，不管其對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類抗生素MIC值或抑菌圈的大小，實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)向臨床報(bào)告為對(duì)所有青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、碳頭孢烯類和β內(nèi)酰胺類—酶抑制劑復(fù)合制劑耐藥，以免誤導(dǎo)臨床用藥。MRSA感染的治療是臨床十分棘手的難題之一，關(guān)鍵是其對(duì)許多抗生素具有多重耐藥性，萬古霉素是目前臨床上治療MRSA療效肯定的抗生素，應(yīng)用30多年來未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株。
(2) 耐青霉素肺炎鏈球菌 (Penicillin resistant Streptococcus pneumoniae,PRSP)
長期以來肺炎鏈球菌對(duì)青霉素高度敏感。MIC在0.005-0.01mg/L之間。1967年澳大利亞首次報(bào)道耐青霉素肺炎鏈球菌,MIC為0.5mg/L，此后世界許多國家和地區(qū)均有報(bào)道，且耐藥率迅速上升。PRSP的耐藥機(jī)制肺炎鏈球菌的青霉素結(jié)合蛋白(PBP)發(fā)生改變，使其與青霉素的親和力減低。肺炎鏈球菌有6種PBP：1a、1b、2x、2a、2b和3，其中PBP2b最為重要，如果青霉素結(jié)合到PBP2b上并使之抑制即導(dǎo)致細(xì)菌溶解和死亡;反之，PBP2b發(fā)生突變，青霉素不能產(chǎn)生作用，則導(dǎo)致PRSP。在PRSP高耐菌株中(MIC≥2μg/m1)可有多達(dá)4種PBP(主要是1a、1b、2x、2b)同時(shí)發(fā)生改變[7]。
肺炎鏈球菌是引起社區(qū)獲得性肺炎的重要致病菌。目前，國內(nèi)PRSP的發(fā)生率在4%左右，明顯低于歐洲國家，在亞洲也屬于中等水平，且MIC多小于1mg/L，因此，在社區(qū)獲得性肺部感染病原菌中，PRSP尚不構(gòu)成嚴(yán)重威脅，青霉素仍可作為首選治療藥物。但是耐藥沒有國界，中國日前PRSP發(fā)生率尚低.但決不意味著不要重視，而是應(yīng)該進(jìn)一步加強(qiáng)PRSP的耐藥監(jiān)測。對(duì)于PRSP感染臨床治療推薦使用頭孢噻肟/頭孢曲松、新喹諾酮類(如司帕沙星)。若屬PRSP嚴(yán)重感染則需應(yīng)用萬古霉素或加用利福平。
2、 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的改變引起喹諾酮類抗生素耐藥
喹諾酮類藥物的作用機(jī)制主要是通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶而抑制DNA的合成，從而發(fā)揮抑菌和殺菌作用。細(xì)菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶有I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，喹諾酮類藥物的主要作用靶位是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ又稱DNA促旋酶，參與DNA超螺旋的形成，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ則參與細(xì)菌子代染色質(zhì)分配到子代細(xì)菌中。革蘭氏陰性菌中DNA促旋酶是喹諾酮類的第一靶位，而革蘭氏陽性菌中拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ是第一靶位。
當(dāng)編碼組成DNA促旋酶的A亞單位和B亞單位及組成拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的parC和parE亞單位中任一亞基的基因發(fā)生突變均可引起喹諾酮類的耐藥性。在所有的突變型中，以gyrA的突變?yōu)橹�，�?0%左右，其次是gyrB、parC和parE突變。在所有這些突變類型中，若Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶上存在2個(gè)突變點(diǎn)(如gyrA和parC上)，它們引起對(duì)氟喹諾酮類的耐藥遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于只有一個(gè)突變點(diǎn)(如gyrA或gyrB上)，前者是后者的3-4倍。同時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)突變僅出現(xiàn)在parC基因這一現(xiàn)象。這可能是因?yàn)镈NA促旋酶是氟喹諾酮類的重要靶位,gyrA亞單位的改變可引起酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化致空間位障，阻止喹諾酮類進(jìn)入喹諾酮類作用區(qū)，或引起物理化學(xué)變化，干擾喹諾酮與酶的相互作用。這些結(jié)果顯示gyrA上突變的出現(xiàn)是引起細(xì)菌對(duì)喹諾酮類發(fā)生耐藥的主要機(jī)制，而parC突變只是進(jìn)一步引起銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮的高度耐藥。
DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的改變是細(xì)菌耐喹諾酮類抗菌藥的主要機(jī)制，其他耐喹諾酮類的機(jī)制還包括后面將要談到的細(xì)菌膜通透性改變和主動(dòng)外排機(jī)制。
三、細(xì)胞膜透性屏障和抗生素主動(dòng)外排泵
細(xì)菌可以通過細(xì)胞壁的障礙或細(xì)胞膜通透性的改變，形成一道有效屏障，使得抗生素?zé)o法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并達(dá)到作用靶位而發(fā)揮抗菌效能，這也是細(xì)菌在進(jìn)化與繁殖過程中形成的一種防衛(wèi)機(jī)制。這類耐藥機(jī)制是非特異性的，主要見于革蘭氏陰性菌。因?yàn)楦锾m氏陰性菌細(xì)胞壁粘肽層外面存在著類脂雙層組成的外膜，外層為脂多糖，由緊密排列的碳氮分子組成，阻礙了疏水性抗菌藥進(jìn)入菌體內(nèi)。另外細(xì)菌外膜上還存在著多種孔蛋白，分子較大者為OmpF，分子較小者為OmpC，它們可形成特異性通道(OprD)和非特異性的通道(OprF)，作為營養(yǎng)物質(zhì)和親水性抗菌藥物的通道�？咕幬锓肿釉酱螅鶐ж�(fù)電荷越多，疏水性越強(qiáng)，則不易通過細(xì)菌外膜。細(xì)菌發(fā)生突變失去某種特異孔蛋白后即可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性,另外由于外膜蛋白OprF的缺失，使藥物不易通過而產(chǎn)生耐藥性。如銅綠假單胞菌特異性孔蛋白OprD2缺失即導(dǎo)致碳青霉烯類抗生素耐藥。
另外一種導(dǎo)致細(xì)菌非特異性耐藥的機(jī)制是細(xì)菌主動(dòng)外排泵的存在，可以將進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的藥物泵出膜外，從而逃避抗生素的作用。主動(dòng)外排系統(tǒng)由于能特異地將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的多種抗菌藥物主動(dòng)泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞獲得耐藥性。如大腸埃希氏菌中的多藥外排泵AcorAB-TolC系統(tǒng)可以導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)包括四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、β—內(nèi)酰胺類、利福平、氟喹諾酮類、氧化劑、有機(jī)溶劑、堿性染料等多種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的藥物耐藥。銅綠假單胞菌的MexAB-OprM系統(tǒng)的主動(dòng)外排作用也是導(dǎo)致銅綠假單胞菌固有的多重耐藥性的重要因素之一。
細(xì)菌的膜耐藥機(jī)制主要表現(xiàn)在銅綠假單胞菌的多藥耐藥性。銅綠假單胞菌幾乎囊括了包括膜耐藥在內(nèi)的所有細(xì)菌耐藥機(jī)制，其耐藥已成為當(dāng)前感染治療中較為棘手的問題之一，尤其值得重視和研究。
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