當歸炭飲片質量標準研究
本文選取甘肅道地產區的當歸，按照《甘肅省中藥炮制規范》規定的方法炮制，采用傳統鑒別和色譜指紋圖譜結合的方法來控制當歸炭飲片的質量，為當歸炭飲片質量控制提供科學依據。
【摘要】
目的建立當歸炭飲片質量控制方法，為其質量標準的制定提供依據。方法觀察當歸炭飲片性狀;對其粉末進行顯微鑒別;根據《中國藥典》規定的方法測定水分、灰分、酸不溶性灰分及其浸出物;采用薄層色譜法對其進行鑒別;基于當歸炭飲片HPLC圖譜，以阿魏酸峰為基準峰，計算阿魏酸的含量，對樣品中指認的指紋峰以阿魏酸為參照，計算每個指紋峰以阿魏酸計的含量。結果當歸炭和生當歸相比，外觀性狀、顯微結構發生了較明顯的變化，組織顏色加深，淀粉粒被糊化，油細胞被破壞。水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物測量平均值分別為3.3%，11.5%，4.1%和49.2%，確定了1個指紋峰，計算出指紋峰以阿魏酸計的含量。結論建立了當歸炭飲片多指標成分的定量方法，方法具有可操作性，使藥品質量控制更全面。
【關鍵詞】
當歸炭飲片; 質量控制; 定量方法; 阿魏酸
Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard of carred Radix. Angelica Sinensis. MethodsTraditional identification， TLC and fingerprints of Carred Radix Angelica Sinensis were adopted to control quality of carred Radix Angelica Sinensis. The ten common peak were appointed as fingerprint peaks， all the fingerprint peaks were quantified grounded on the peak of Ferulic acid. Referring to China Pharmacopoeia (25)， water， ash， and extract were also detected.
ResultsAppearance， microscopic structure of Radix Angelica Sinensis changed obviously， color of tissue deepened， starch granule gelatinized， oil cells were destroyed. The content of water， total ash， acid-insoluble ash and extract were 3.3%，11.5%，4.1%and 49.2%， respectively. Ten fingerprint peaks were defined， and quantified rested on the peak of ferulic acid. ConclusionA multicomponent quantitative method for the carred Radix Angelica Sinensis was established. The established method is feasible. The quality control standards of the carred Radix Angelica sinensis is normative， systematic and accurate.
Key words： Carred Radix Angelica Sinensis; Quality standards; Quantitative method; Ferulic acid
當歸為傘形科當歸屬植物當歸Angelica sinesis(Oliv.)Diels的干燥根[1]，主產于甘肅岷縣，屬甘肅地道藥材，主要成分含揮發油和水溶性物質兩大類。揮發油中以藁本內酯和正丁烯酉夫內酯為主要成分;水溶性物質以阿魏酸和丁二酸為主要成分[2]，是中(獸)醫臨床常用藥，性溫，味甘、辛，具有補血活血、調經止痛、潤燥滑腸等功效。當歸炭入藥，最初見于明代方賢《奇效良方》成為“火化法”，之后清代又有“煅法”“燒法”的記錄，如“燒末為灰”，但均需存性，當歸炭至今仍為中醫臨床所選用[3]，由于當歸本有活血作用，炒炭后又善止血，所以當歸炭尤宜于瘀阻出血證。當歸炭質量優劣直接關系到中醫及中獸醫臨床的療效，而目前還沒有一個系統的質量控制的方法。因此，本文選取甘肅道地產區的當歸，按照《甘肅省中藥炮制規范》規定的方法炮制，采用傳統鑒別和色譜指紋圖譜結合的方法來控制當歸炭飲片的質量，為當歸炭飲片質量控制提供科學依據。
1 材料與儀器
1.1 實驗儀器顯微鏡，自動薄層制板器，KQ-36DE型數控超聲波清洗器，玻璃儀器烘干器，TDI5-WS多管架自動平衡機，電子天平，克羅瑪-薄層觀察分析儀(254nm，365nm)，容量瓶，坩堝，電熱恒溫鼓風干燥箱，SX-4-1智能纖維素電阻爐，循環水式多用真空泵(型號SHB-111)。
1.2 實驗藥品乙醚、乙醇、石油醚、醋酸乙酯、1%碳酸氫鈉、甲醇、硅膠G薄層、阿魏酸、正己烷、苯、2%碳酸鈉、水合氯醛、稀甘油等所用試劑均為分析純。當歸對照藥材(批號12927-2613中國藥品生物制品檢定所)，阿魏酸對照品(批號773-991中國藥品生物制品檢定所)。
1.3 當歸炭取當歸片，置鍋內，用中火炒至當歸外表焦黑色，內部棕褐色，略具焦氣，質枯脆時， 取出放涼。并要注意“炒炭存性”[4]。不同產地當歸炭樣品分別為t1甘肅漳縣金鐘鎮;t2甘肅岷縣中寨鎮;t3甘肅九寨鎮;t4甘肅岷縣;t5甘肅渭源縣;t6甘肅渭源縣;t7甘肅渭源縣;t8甘肅岷縣;t9甘肅昌縣;t1號甘肅漳縣;t11甘肅昌縣哈達鋪;t12甘肅漳縣;t13甘肅岷縣;t14甘肅省岷縣市場購買。
2 方法
2.1 飲片性狀當歸炭：當歸頭切片有大有小，最大的長為2.6 cm，寬為1.7 cm，厚為.2 cm;最小的長為1.2 cm，寬為1. cm，厚為.1 cm，表面顏色為黑色具縱皺紋，斷面形成層為深褐色具環紋，木質部為棕褐色，還混有粗細、長短不一的歸身、歸尾其表面均為黑色，根頭部斷面層有裂縫。掰開斷面顏色為黃棕色，質脆，香氣較濃味苦、微甜。見圖2。
2.2 飲片鑒別
2.2.1 粉末顯微鑒別當歸炭：粉末為焦黑色，可觀察到梯紋、網紋、螺紋導管呈棕褐色，木栓細胞也呈棕褐色，紡錘形薄壁細胞有但較少，碎片較多油室基本少見，淀粉粒糊化。見圖3。
2.2.2 薄層色譜鑒別取14個產地當歸炭粉末.5 g，加乙醚1 ml，超聲處理1 min，濾過，取濾液蒸干，殘渣加乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取標準當歸粉末.5 g，依供試品同法操作，即為對照品溶液;吸取上述15種溶液各5 μl，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以石油醚(3～6℃)醋酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈下365 nm波長處觀察熒光斑點。見圖4。
取14個產地當歸炭飲片粉末3 g，加1%碳酸氫鈉5 ml，超聲處理1 min，離心，取上清液，用稀鹽酸調至pH值2～3，用乙醚振蕩萃取兩次，2 ml/次。合并乙醚液蒸干，殘渣加甲醇1ml，使溶解，作為供試品溶液。吸取上述14種溶液各1 μl，分別點于同一塊硅膠G薄層板上;另吸取1 μl阿魏酸點于同一塊硅膠G薄層板上作為對照樣品。以正苯-醋酸乙酯-甲酸(4∶1∶.1)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈下365 nm波長處觀察熒光斑點。見圖5。
2.3 檢查照《中國藥典》25 年版Ⅰ部(附錄)，分別測定當歸樣品中的水分，總灰分，酸不溶性灰分，浸出物測定法項下醇溶性浸出物測定法熱浸法測定。結果見表1。表1 14個產地當歸樣品中水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物測定結果(略)
2.4 基于當歸炭飲片的HPLC圖譜的樣品含量測定
2.4.1 色譜條件Agilent Zorbax SB2C18 (4.6 mm×25cm，5μm)分析柱;流動相:1%乙酸水(A相)：乙腈(B相);梯度洗脫條件:B，～1 min (8% ～13%);18～2min(13%～18%);2～28min(18%～2%);28～5 min (2%～49% );5～55 min (49% );55～75 min(49% ～1%)。流速:1 ml·min-1;柱溫:25 ℃;檢測波長:28 nm。
2.4.2 阿魏酸對照品溶液制備稱取阿魏酸對照品4.8 mg，加甲醇至1 ml容量瓶中，得4.8 μg·ml-1對照品溶液。
2.4.3 供試品溶液制備精密稱取當歸粉末(4目).5 g，置5 ml具塞三角瓶中，精密量取甲醇-甲酸(95∶5)溶液25 ml加入三角瓶中，密封，稱重，超聲提取6 min，放置至室溫，稱重，補足失重， .45 μm濾膜過濾。取續濾液進樣1 μl。
2.4.4 指紋峰的鑒定采用相對保留時間確認峰。指紋峰峰面積比值即各指紋峰面積與同一圖譜中阿魏酸峰面積的比值。
3 結果
3.1 方法學考察精密度 取同一份當歸樣品(t4)的供試液，重復進樣5次，計算得各主要色譜峰的相對保留時間RSD為.3%～.14% ， 峰面積比值RSD為.54%～2.6% ，符合指紋圖譜的檢測要求。
3.1.1 穩定性取同一份當歸樣品(t4)的供試液，分別于，3，6，9，12和15 h檢測，計算各主要色譜峰的相對保留時間RSD為.3%～.12%，峰面積比值RSD為.29%～2.66% ，表明供試液在15 h內基本穩定。
3.1.2 重復性取當歸樣品(t4) 6份，分別精密稱定，按供試品溶液制備方法平行制備供試液，再分別按上述液相色譜條件測定， 計算各主要色譜峰的相對保留時間RSD為.28% ～.46%，峰面積比值RSD為.75% ～1.82% ，符合指紋圖譜的檢測要求。
3.1.3 當歸樣品中指紋峰的定量按上述液相色譜條件測定了自14個不同產地的當歸炭樣品，根據各樣品圖譜中色譜峰的相對保留時間和阿魏酸對照品的相對保留時間，鑒定1個指紋峰，見圖6。峰1為阿魏酸，將指紋峰的紫外光譜與文獻[5～8]比較，推測峰2～1依次為洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、丁基酜內酯、E-藁本內酯、Z-藁本內酯、Z-丁烯基酞內酯、levistolide A.。對這些指紋峰含量以基準峰阿魏酸為依據，計算每個指紋峰的相對含量。結果見表2。表2 14批當歸炭樣品指紋峰以阿魏酸計相對含量測定結果(略)
4 討論
“道地藥材”是公認的優質藥材，可以用某中藥的道地藥材的質量情況作為該中藥的質量標準。本研究選擇甘肅道地產區的當歸樣品，對當歸炭(14批)各組研究數據資料進行系統分析，以此為基礎制定當歸炭飲片的名稱、藥材來源、飲片規格、顯微鑒別、水分限量、總灰分限量、酸不溶性灰分限量、浸出物限量及以阿魏酸為基準的有效成分相對含量下限等質量標準。研究發現當歸炭的顯微結構發生了較大的變化，組織顏色加深、油細胞減少、淀粉�；径急缓�，而其外部變化也非常明顯，如表面呈焦黑色等，水分含量明顯下降，而灰分含量明顯增加，建議在制定當歸炭飲片質量標準時考慮。
當歸炭飲片作為多組分復雜體系，其化學成分經過炒炭以后發生了很多變化，如宋金春[9]報道，制炭后，阿魏酸含量顯著降低，鞣質顯著增加，水溶性和醇溶性成分均有下降，加上藥材品種、產地、加工、貯藏等因素的影響，其質量控制一直是當歸炭飲片分析的重點和難點。目前對當歸炮制品的研究大多停留在飲片的性狀鑒別，25版《中國藥典》上只是規定了酒當歸飲片的性狀，沒有化學成分的鑒別方法，無法從化學組分的內在因素上鑒定當歸炮制品以控制其質量，且對當歸藥材只規定了阿魏酸含量的限度，也不能代表整個藥材的質量[1]，同時市場上能形成商品的對照品數量較少，一味藥多成分定量就成為質量分析的難點。本研究針對以上問題，在分析出的組分中盡可能多地選取含量測定對象，選擇一個能代表某味藥材的組分色譜峰， 然后再選擇其他各味藥材代表峰，并對代表峰與標準峰比值作一限度范圍，即可對所要檢測中藥做出一個較好的定性定量，以此來控制制劑的質量[11]。本文采用以阿魏酸單一對照品為基準對多指標成分定量分析方法，測定洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、丁基酜內酯， E-藁本內酯、Z-藁本內酯、Z-丁烯基酞內酯、levistolide A 1種成分以阿魏酸計的相對含量，這樣可以全面控制當歸炭飲片的質量，提高當歸炭飲片質量控制水平，為其質量評價提供科學依據，同時為當歸炭飲片的生產、經營及鑒定提供了參考標準。
【參考文獻】
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