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體內損傷構建椎間盤退變動物模型的研究進展
【摘 要】 按照構建椎間盤退變動物模型時的損傷方式對體內構建退變椎間盤動物模型的方法進行綜述。體內構建椎間盤退變動物模型的方法很多，但各有優(yōu)缺點，在以后的實驗過程中進一步研究和建立綜合模型仍然是努力的目標。
【關鍵詞】 椎間盤;動物模型;體內損傷;綜述
近年來，隨著人們生活和工作習慣的改變，椎間盤退變性疾病(disc degeneration disease，DDD)已成為現(xiàn)代人群中常見的疾病。本病是造成頸、肩、腰、腿痛的主要原因，嚴重影響了人們的生活和工作，甚至有些患者因出現(xiàn)嚴重的神經損傷癥狀而不得不行手術治療，給患者帶來巨大的精神和經濟負擔。為了更好地探索本病的發(fā)生機制及治療方法，20多年前，人們開始運用具有與人類椎間盤高度相似性的動物退變椎間盤來研究本病的病因病機，尋找更好的治療方法。近幾年，用于構建動物模型的種類和造模的方法主要分為2大類型：體內損傷動物模型和體外動物模型。體內損傷動物模型主要指通過干預、誘導動物椎間盤退變，依據(jù)其在影像學、形態(tài)學和生物化學等方面的變化，動態(tài)觀察動物椎間盤退變的病理過程。體外動物模型是指在體外培養(yǎng)的細胞和器官模型，此模型多用于短期的實驗觀察，實驗結果論證能力弱。筆者通過查閱近十年來大量的國內外文獻，總結了在動物體內構建椎間盤退變模型的方法，并分析每種方法的優(yōu)缺點。
1 動物的選擇
從開始使用動物構建椎間盤退變模型到現(xiàn)在，研究者嘗試了各種各樣的動物，總結出用于構建椎間盤退變模型的動物應符合如下幾個條件[1]：
①所用動物脊柱的解剖特點、生物力學特性、生理、病理功能等應與人類高度相似;②所選動物可客觀地重復椎間盤退變的病理過程;③所構建的動物模型具有可復制性;④動物價格較為便宜，且較易飼養(yǎng)，種群數(shù)量較多。目前，很多小型哺乳動物及嚙齒類動物被學者作為動物模型;但是由于某些倫理因素[2]，現(xiàn)如今大多數(shù)學者采用鼠及兔作為建模動物[3]。
2 構建椎間盤退變模型
2.1 生物力學模型(biomechanical model，BM) Goff等[4]運用手術方式培訓大鼠，改變其爬行習慣使其靠雙后肢如人類直立行走，從而使大鼠的椎間盤發(fā)生退變，他也是首個通過改變大鼠行走習慣來構建椎間盤退變動物模型的學者。本造模方法簡單經濟、成功率高、重復性好，建立的雙后肢大鼠模型符合人體椎間盤退變規(guī)律;但是其與倫理道德相悖，多數(shù)學者不贊成用此種方法建模。張超等[5]將兔子固定在PVC管中，并將PVC管直立，使兔子腰椎受力負荷增加，8周后發(fā)現(xiàn)兔子的脊柱高度發(fā)生明顯降低，椎間盤發(fā)生明顯退化，這說明了通過強迫直立位下，因自身身體重力負荷對椎間盤產生影響可以成功建立椎間盤退變模型。Barbir等[6]將大鼠尾巴固定在U型架上，在一段時間后發(fā)現(xiàn)尾椎椎間盤出現(xiàn)退變，證實椎間盤退變的程度與應力改變有關。熊曉芊等[7]通過軸向加壓構建兔子椎間盤退變模型發(fā)現(xiàn)，通過軸向加壓可使兔子腰椎間盤發(fā)生明顯退化。
BM對實驗動物損傷較微小，具有操作簡便、經濟、效果可靠等優(yōu)點。在誘發(fā)輕度椎間盤退變模型時見效快，造模的效率較高，通過該方式建模，椎間盤的結構及基質的改變與人體椎間盤退變的過程大致相似，可滿足基因治療時需要長期觀察療效的實驗研究的需要。
2.2 機械損傷模型(mechanical damage model，MDM)
指運用各種方式破壞動物的椎間盤纖維環(huán)、髓核、終板或通過手術破壞棘上、棘間韌帶、椎旁肌肉和棘突等改變造模動物脊柱的力學分布，改變椎間盤內環(huán)境，從而獲得椎間盤退變動物模型。
2.2.1 纖維環(huán)損傷模型 通過針刺、刀片切割等方法，直接造成纖維環(huán)的物理損傷。Osti等[8]是較早用該方法構建動物椎間盤退變模型的學者，其通過手術方式切除羊的部分纖維環(huán)，4個月后發(fā)現(xiàn)羊的椎間盤發(fā)生了明顯的退變。Wang等[9]運用21號針頭針刺破壞大鼠纖維環(huán)，在數(shù)周后發(fā)現(xiàn)其椎間盤發(fā)生了明顯退變。崔運能等[10]在CT引導下，用18 G穿刺針經側方皮下穿刺兔L5～6椎間盤，確認刺入椎間盤纖維環(huán)深度約為5 mm，在84 d后，實驗組影像學上見兔的椎間盤高度下降，終板骨質硬化;組織學上見纖維環(huán)結構紊亂、髓核細胞輕度減少。崔力揚等[11]用21號針頭針刺大鼠全層纖維環(huán)和部分纖維環(huán)，4周后大鼠椎間盤在影像學上發(fā)生明顯變性，而部分大鼠在8周后才可見到此現(xiàn)象。
通過針刺損傷纖維環(huán)構建椎間盤退變模型時，其退變的過程較為緩慢，退變的程度與損傷的大小之間存在明顯的正相關性，此為一較為緩慢推進的過程，可較充分地再現(xiàn)椎間盤退變的發(fā)展規(guī)律，與人類椎間盤退變病理變化過程較為相似，且造模過程簡單，易重復，故可以作為椎間盤退變研究的動物模型。但需要精確地把握穿刺時所選的穿刺針的型號及進針的位置和針刺的深度，且手術過程中常需采用腹部或者其他手術切口，創(chuàng)傷大，易造成腹膜及腹腔臟器的損傷，極大地傷害了造模動物，增加感染的機率，較難保證造模動物的存活率。
2.2.2 髓核損傷模型 該方法主要是通過穿刺、抽吸模型動物脊柱椎間盤髓核，造成髓核退變，從而引發(fā)模型動物椎間盤退變。陳國仙等[12]通過模擬人后路髓核摘除構建大鼠椎間盤退變動物模型，培養(yǎng)8周后發(fā)現(xiàn)大鼠椎間盤的髓核細胞明顯減少，纖維環(huán)結構發(fā)生明顯改變。Liu等[13]在磁共振引導下，用16號穿刺針經皮穿刺抽吸白兔椎間盤部分髓核，造成白兔髓核損傷誘導椎間盤退變模型。
通過針刺損傷動物椎間盤髓核構建椎間盤退變模型具有創(chuàng)傷小、劑量麻醉少、損傷小、動物模型存活率較高、操作時間短等優(yōu)點，而且通過此方法構建的模型出現(xiàn)椎間盤退變的時間較早，進程較快，程度較重，故可以作為椎間盤退變研究的動物模型。同時它也存在著較難確定皮膚手術進針點，易損傷脊神經及容易形成椎體旁骨贅等不足，要求操作者有較高的技術及較豐富的經驗。如果可以在影像透視指導下行刺，將會更加符合當今世界上倡導的微創(chuàng)趨勢。
2.2.3 終板損傷模型 在成人中，髓核細胞的營養(yǎng)主要來自軟骨終板的滲透作用，所以當軟骨終板結構發(fā)生改變時，便直接影響髓核細胞的代謝，同時由于椎間盤內部力學特性的改變，椎間盤形態(tài)可發(fā)生改變，造成椎間盤退變。該方法操作過程為：經過模型動物的椎體鉆1個斜行的空洞，直達軟骨終板，形成急性終板損傷引起髓核壓力降低和應力重新分布，從而導致椎間盤退變。操作時需注意掌握深度，不要貫穿上下終板。Yuan等[14]通過破壞豬的椎體終板，9周后發(fā)現(xiàn)家豬的椎間盤內環(huán)境發(fā)生明顯的改變，椎間盤炎癥介質明顯增多，纖維環(huán)發(fā)生明顯的破壞性改變。
終板下方有著豐富血供的骨質，含有數(shù)量巨大的免疫細胞，因此，通過損傷終板來構建椎間盤退變模型，其退變的速率比纖維損傷等方法發(fā)生更快，進展更迅速，且其退變的程度也更加嚴重，為一種快速腰椎退變的動物模型，可以用來研究人類椎間盤退變的病理、生理及形態(tài)學變化。它也存在著定位難、容易形成骨贅等不足。
2.2.4 椎旁的結構損傷模型 該方法主要是通過手術破壞模型動物的脊柱支持組織或椎體、椎間關節(jié)融合等手段可使脊柱過度運動，造成脊柱失穩(wěn)、造成椎間盤受力不平衡，而導致椎間盤退變。Zhou等[15]通過切斷大鼠頸部部分，造成頸部力學失衡，從而導致大鼠椎間盤纖維環(huán)明顯被破壞。
Woiciechowsky等[16]對小鼠行脊柱融合術，在3個月后發(fā)現(xiàn)小鼠纖維環(huán)部分變性。
該方法并未直接人工干預損傷動物模型的椎間盤，保持了動物椎間盤的完整性，與人類椎間盤自然退變的過程較為相似，可作為短期研究人類椎間盤退變的動物模型。該方法有對動物損害較大，且手術并發(fā)癥較多，易造成造模動物存活率低等缺點。
2.3 化學損傷模型(chemical damage model，CDM)
使用藥物注射構建椎間盤退變動物模型是最近幾年來新的發(fā)展趨勢，并有了較大的進展。該方法主要是在盡量少損壞模型動物椎間盤纖維環(huán)、終板及脊柱周圍力學結構的前提下，將某些化學藥品注射到椎間盤髓核內，造成髓核溶解，引起椎間盤退變。從大量的文獻報道中可以發(fā)現(xiàn)，主要是向動物椎間盤內注入酶類物質，例如木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)或纖維結合蛋白(binding protein fiber，BPF)，從而使髓核細胞發(fā)生變性、死亡，蛋白多糖(proteoglycan)的急劇降低，造成椎間盤的退變。近年來，也有學者通過切除動物的子宮，改變動物體內激素水平，從而加速椎間盤的退變，構建椎間盤退變動物模型。Zhan等[17]在X線透視下，向髓核內注入1 mg BPF，3周后X線片顯示椎間盤脫水變薄，磁共振可見T2像信號強度減弱，提示椎間盤退變。Furtw ngler等[18]把牛尾椎間盤置于蛋白水解酶(proteolytic enzymes，PE)混合物的培養(yǎng)基中3周，發(fā)現(xiàn)椎間盤中央區(qū)變性、糖胺聚糖(sugar glycosaminoglycans，SG)含量下降。王娜等[19]將纖連蛋白片段注入大白兔的椎間盤中心區(qū)域，10周時觀察到髓核細胞數(shù)量明顯減少，細胞變圓，呈明顯的成簇聚集分布，纖維環(huán)排列明顯的不規(guī)整，各層間出現(xiàn)裂隙，甚至斷裂，蛋白聚糖染色明顯變淺，甚至部分未見染色，椎間盤發(fā)生明顯退變。Woiciechowsky等[16]通過多年的跟蹤和檢測發(fā)現(xiàn)，婦女在絕經后其椎間盤的退變速度明顯加快。
化學損傷誘導兔椎間盤退變模型與人類椎間盤退變的過程更相似，生物化學特質更接近，模型可重復性強，退變周期較長，適用于分子水平研究椎間盤退變的動物模型。同時它也具有退變發(fā)生快，對造模動物損害大，成本高，難通過調節(jié)注射劑量來調控退變程度等缺點。
2.4 手術植入模型 通過手術方式，植入介質，從而壓迫脊髓、神經，構建椎間盤退變模型。這種方法多用來構建椎間盤突出、脫出或者是椎管內占位的動物模型。王雪喬等[20]通過半椎板切除術，暴露L1脊髓，并置入球囊，構建腰椎間盤突出癥狀。
3 結 語
綜上所述，體內損傷構建椎間盤退變模型常用的方法均有各自的優(yōu)缺點，在實際的造模過程中，應該根據(jù)具體的實驗情況及實驗室條件選擇較為合適的造模方法。但是無論采取哪一種方法，比較理想的椎間盤退變動物模型要求跟人類的椎間盤退變的過程具有可比性、相似性，所選擇的實驗動物應遵循“3R”原則，同時也應具有經濟、簡單、來源充足的特點，應當設計及構建臨床實用性強的椎間盤退變模型。需要借助現(xiàn)代醫(yī)療科學技術，不斷探索何種條件建立安全、有效、與人體真實情況相似、容易重復獲得的椎間盤退變動物模型。
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