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仙人掌多糖對高脂血癥大鼠體內(nèi)抗氧化作用的研究
【摘要】目的探討仙人掌多糖(OPS)對高脂血癥大鼠體內(nèi)抗氧化、清除體內(nèi)自由基的生物效應(yīng)。方法 將8～10周齡高脂血癥大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，建立高脂血癥大鼠模型，取肝臟勻漿測定天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性,并測定心臟組織SOD活性、MDA含量和抗超氧陰離子自由基活性。結(jié)果給藥10d后，OPS中、高劑量組與模型組比較，肝臟ALT活性、AST活性、心臟MDA含量顯著降低;心臟抗O-2·活性、SOD活性顯著增強(qiáng)。結(jié)論仙人掌多糖可能通過有效清除體內(nèi)的氧自由基及抗脂質(zhì)過氧化，實(shí)現(xiàn)其體內(nèi)抗氧化的作用。
【關(guān)鍵詞】仙人掌多糖 高脂血癥 氧化
Abstract：ObjectiveTo investigate the antioxidative effects of Opuntia dillenii Haw.polysaccharides(OPS) on hyperlipidemia rats in vivo. MethodsSixty rats were randomly divided into six groups.OPS was given to hyperlipidemia rats through gavage for 10 days. Then the activities of ALT and AST in rat liver were determined, meanwhile heart was sampled for measurement of MDA content, activity of SOD and the anti-superoxide anion free radical (O-2· ) respectively. ResultsCompared with control group, OPS could increase SOD activity , decrease the activities of ALT and AST, and reduce the content of MDA and O-2·.Conclusion OPS has significant antioxidative activity and the mechanism may be related with oxygen free radical elimination and anti-lipid peroxidation.
Key words：Opuntia dillenii Haw. polysaccharides(OPS); Hyperlipidemia; Anti-oxidation
多糖是一類具有生物活性的生命大分子物質(zhì),它在抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥、刺激免疫以及降血糖方面都有一定的作用[1]。仙人掌多糖(OPS)是從仙人掌科植物仙人掌Opuntia dillenii. Haw的新鮮莖中提取的多糖。本研究試圖通過測定高脂血癥大鼠肝臟天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性,心臟丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性，并檢測抗超氧陰離子自由基 (O-2·)活性的變化，探討OPS在體內(nèi)抗氧化的情況，以期為OPS的開發(fā)利用提供依據(jù)。
1、材料與儀器
1.1 動物SD大鼠(SPF級，動物合格證號：粵檢證字2004A027)，雄性，8～10周齡，體質(zhì)量180～200 g，購于廣東醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心。
1.2 藥品及試劑 仙人掌Opuntia dillenii. Haw于2007-10采自湛江東海島附近，仙人掌多糖(Opuntia dillenii Haw.Polysaccharides，OPS)提取參照蘭琦杰[2，3]等人的方法進(jìn)行。
膽固醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號F20070216);丙基硫氧嘧啶片(南通精華制藥有限公司，批號：061001);脫氧膽酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：F20070521);脂必妥片(成都地奧九泓制藥廠，批號：0612069)。血清測定TC、TG試劑盒(南京建成生物工程研究所出品，批號：20070512) ;肝臟測定ALT、AST試劑盒(南京建成生物工程研究所出品，批號：20070312、20070402) ;心臟測定SOD、MDA和O-2·試劑盒(南京建成生物工程研究所出品，批號： 20071010、20071029、20071102)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
高脂乳劑的配制[4～6]：取豬油25 g放在200 ml的燒杯里，放在磁力攪拌器上加熱，待溫度升到100℃時，加入10 g 膽固醇，溶化，再加入1g丙基硫氧嘧啶片，充分?jǐn)噭颍缓蠹?5 ml 吐溫-80 ,制成油相。同時在另一燒杯中加30 ml蒸餾水和1,2丙二醇20 ml，放在電爐上加熱至60℃，然后加入2 g脫氧膽酸鈉,充分?jǐn)嚢柚钡酵耆芙猓瞥伤�。然后將水相加入油�?充分混勻,即制成脂肪乳劑。
1.3 儀器 Olympus CKX41倒置顯微鏡， LEICA Rm2245電動進(jìn)樣切片機(jī)。
2、方法
2.1 高脂血癥動物模型的建立及分組[7，8]60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組(10只)和造模組(50只)。造模組喂飼高脂乳劑10 d后測定空腹血清TC、TG含量，將TC>6 mmol·L-1及TG>3 mmol·L-1的實(shí)驗(yàn)大鼠確定為高脂血癥動物模型，50只大鼠隨機(jī)分為低、中、高仙人掌多糖組(OPS治療組，劑量分別為100，200，400 mg·kg-1·d-1)、模型組和藥物對照組(脂必妥藥物組)，每組10只。OPS組和脂必妥藥物組分別每天上午按劑量灌胃OPS或脂必妥片，各組動物下午灌胃生理鹽水或高脂乳劑。
2.2 實(shí)驗(yàn)處理 在實(shí)驗(yàn)的第4周末，所有動物禁食8 h，不禁水，此后腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，固定于鼠板上，開胸剝離出肝臟及心臟，去除油脂，取心尖部分置于福美琳溶液中固定，逐級酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)切片厚4 μm，HE染色，倒置顯微鏡下觀察。其余部分用于各指標(biāo)的測定。
2.3 統(tǒng)計學(xué)分析測定結(jié)果以±s表示，多組間均數(shù)比較采用Duncan多重檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理均采用SAS system 8.2 統(tǒng)計軟件進(jìn)行。
3、結(jié)果
3.1 仙人掌多糖對高脂血癥大鼠肝臟ALT、AST活性的影響分別采用2,4-二硝基苯肼法測定肝臟勻漿ALT活性，IFCC法測定肝臟勻漿AST活性。高脂血癥大鼠ALT活性、AST活性與正常組比較分別升高了133.3%，76.6%,達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。藥物對照組，OPS中、高劑量組ALT活性比模型組分別降低了69.17%、65.08%、74.33%，差異極顯著 (P<0.01)，高劑量組效果優(yōu)于藥物對照組。低劑量組與模型組相比alt活性降低22.48%，無顯著差異(p>0.05);藥物對照組，OPS治療組均不同程度的抑制AST活性的升高，其中OPS低劑量組與模型組比較，AST活性降低21.36%存在較顯著差異(P<0.05)，OPS中、高劑量組、藥物對照組與模型組比較各降低了50.55%，49.31%，57.25%，接近正常水平，達(dá)到極顯著差異 (P<0.01)。結(jié)果見表1。表1 仙人掌多糖對高脂血癥大鼠肝臟ALT、AST活性的影響(略)
3.2 仙人掌多糖對高脂血癥大鼠心臟SOD活性、MDA含量、抗(O-2·)活性的影響心臟勻漿后按照黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，改良硫代巴比妥酸法測定MDA含量和黃嘌呤氧化酶法測定抗O-2·活性。表2 仙人掌多糖對不同組別大鼠心臟中SOD活性及MDA含量，表3 仙人掌多糖對不同組別大鼠心臟中抗 O-2·活性的影響(略)。
從表2可見，與正常組比較，模型組大鼠心臟組織SOD活性略升16.58%，可能是體內(nèi)的應(yīng)激性反應(yīng)造成SOD活性暫時增加;模型組大鼠心臟組織MDA含量則顯著增加了184.88%(P<0.01)。而OPS治療組與模型組比較，治療后高劑量組SOD活性較明顯升高了8.60%(P<0.05);OPS治療組均能顯著降低MDA含量(P<0.01)，降低率為24.91%，29.75%，27.53%,與陽性組無顯著性差異。
從表3可見，與正常組比較，模型組大鼠心臟組織抗超氧陰離子自由基(O-2·)活性升高72.96%(P<0.01);而與模型組比較，治療后高劑量組抗O-2·活性進(jìn)一步增加了34.89%，達(dá)到極顯著水平(P<0.01)且效果優(yōu)于藥物對照組。
3.3 心臟病理學(xué)觀察見圖1。
3.3.1 正常組心肌纖維肥大不多見，結(jié)構(gòu)正常，心肌細(xì)胞邊界清楚，心肌間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常。心肌纖維分布均勻，結(jié)構(gòu)基本完整;心肌細(xì)胞顏色鮮艷。
3.3.2 高脂模型組心肌細(xì)胞壞死,心肌細(xì)胞邊界模糊，心肌纖維排列紊亂,心肌纖維肥大，脂質(zhì)斑塊不規(guī)則,突出于管腔內(nèi);心肌細(xì)胞顏色比較暗淡。
3.3.3 OPS中劑量治療組心肌纖維分布較均勻，仍有較多的脂質(zhì)沉積，病變略微好于模型組;心肌細(xì)胞顏色略鮮艷于模型組。
3.3.4 OPS高劑量治療組心肌纖維分布均勻，無明顯脂質(zhì)沉積，病變明顯好于模型組;心肌細(xì)胞顏色接近于正常組。
4、討論
ALT和AST主要來源于肝臟，各種肝損傷發(fā)生時，該酶活性顯著增高，所以我們通過測定ALT和AST活性，以評價大鼠肝臟氧化損傷程度[9～11]。SOD是機(jī)體細(xì)胞中主要抗氧化酶,是維持生物體自由基產(chǎn)生和過氧化物清除能力平衡的重要物質(zhì)。SOD是需氧生物體內(nèi)的一種內(nèi)生性氧自由基清除劑，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，也是體內(nèi)清除O-2·的主要酶，它能夠催化O-2·歧化為H2和O2，清除氧自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷。血脂升高時,脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng), MDA含量增多，SOD 活性降低[12～14]。超氧陰離子(O-2·)是活性氧自由基(oxygen free radical，OFR)其中的一種，也是生物體內(nèi)的主要自由基，它作為機(jī)體氧化還原反應(yīng)的產(chǎn)物在體內(nèi)廣泛存在，在很多情況下對機(jī)體是有害的，超氧陰離子是導(dǎo)致衰老的原因之一。心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts, CF)是心肌纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞,其增殖及產(chǎn)生的膠原代謝平衡失調(diào)是心肌纖維化的主要病理基礎(chǔ)。這些變化將導(dǎo)致心肌代謝及功能異常，使其僵硬度增高、舒縮功能障礙，最終引發(fā)心力衰竭[15]。
本實(shí)驗(yàn)證明OPS能極顯著降低高脂血癥大鼠肝臟組織ALT和AST活性，較顯著提高心肌組織SOD活性和抗O-2·活性，顯著降低高脂血癥大鼠心臟組織中的MDA含量，表明OPS可保護(hù)高脂血癥時機(jī)體內(nèi)抗氧化物酶類活性,使多種組織存在的自由基代謝紊亂情況得以糾正，從而維持機(jī)體氧化及抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡，減少自由基的積累，減輕過氧化作用對機(jī)體的損傷。
與正常組相比，高脂血癥模型組大鼠心肌細(xì)胞肥大，心臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞的衰老及合成的心肌間膠原含量增加，膠原降解減少，心肌細(xì)胞大量壞死，最終致心臟舒張和收縮功能的障礙[16，17]。 OPS中劑量治療組，心肌纖維分布較均勻，仍有較多的脂質(zhì)沉積，病變有所改善;高劑量治療組，心肌纖維分布均勻，心肌細(xì)胞邊界較清楚，病變明顯好于高脂血癥模型組。結(jié)果表明OPS具有較強(qiáng)的抗氧化作用和清除氧自由基的能力，提示OPS可能通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)清除O-2·能力，提高心臟抗氧化能力，防止心臟成纖維細(xì)胞老化，減少脂質(zhì)沉積，進(jìn)而有效抵抗OFR對心臟的氧化損傷[18]。
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