研究地榆提取物的抗氧化與抗過敏作用及其相關性

研究地榆提取物的抗氧化與抗過敏作用及其相關性

摘要:　目的研究地榆提取物的抗氧化與抗過敏作用及其相關性。方法地榆經乙醇提取，有機溶劑萃取，大孔樹脂HP-20分離純化，獲得不同提取部分。采用透明質酸酶抑制率及對DPPH、羥基自由基、過氧化氫的清除作用來檢測提取物活性。結果地榆大孔樹脂40%乙醇洗脫物透明質酸酶的抑制率與各自由基清除率是所有提取物中最高的，其自由基清除率接近于原花青素和蘆丁，大于維生素C和兒茶素；地榆的提取物濃度與透明質酸酶抑制率、氧自由基清除作用成正相關性。結論地榆是一種值得開發的抗過敏、抗氧化植物；地榆提取物的抗過敏機制與其具有較強的氧自由基清除作用有關。

關鍵詞: 地榆 抗氧化 抗過敏

　　地榆Sanguisorba officinalis L.是薔薇科(Rosaceae)地榆屬Sanguisorba L.植物的根及根狀莖,具有涼血止血，解毒斂瘡功效。主要分布于中國東北 、華北 、西北 、華東 、中南及廣西 ，廣布于歐洲和亞洲北溫帶，主要成分為鞣質和三萜皂苷。研究表明地榆提取物能對抗ONOO-的腎損害作用，抑制細胞凋亡，改善氧化應激和氧化損傷作用［1～3］。國外Katsumata［4］報道抗氧化劑可以有效治療過敏性疾病，因為活性氧如超氧陰離子自由基、羥自由基促使肥大細胞釋放組胺，產生過敏反應，因此，從地榆的成分以及抗炎癥、抗氧化的效果看，地榆可能是良好的抗過敏植物來源。
　　但是從目前的文獻報道來看，地榆的抗過敏研究報道較少，主要集中在地榆的粗提物上，如地榆水提液可以明顯使實驗小鼠增強2，4-二硝基氯苯所致遲發型過敏反應，使鼠耳重量增加，具免疫增強作用［5］。地榆根的粗提物能夠抑制組胺介質的釋放和TNF-α的產生，具有良好治療即時型過敏的效果［6］。雖然Park KH通過老鼠的被動皮膚測試及由compound 48/80 和Ca2 引發的過敏測試，表明了地榆對肥大細胞的抑制作用，其主要作用成分為5-O－α-D-(3-C－羥甲基) 呋喃來蘇糖基－β－D－（2-羥甲基）阿拉伯呋喃糖的雙糖［7］，但沒有更多的報道過抗過敏的有效成分。鑒于純天然植物的安全無副作用以及地榆的研究現狀，本文對地榆的粗提物進行了初步分離，探討地榆提取物的抗氧化與抑制透明質酸酶間的作用和內在的關系，為抗過敏植物資源的開發提供理論基礎。
　　1 材料與儀器
　　1.1 試劑透明質酸鉀、透明質酸酶，Sigma公司產品；對-二甲氨基苯甲醛（AR），上海試劑二廠產品；乙酰丙酮，天津試劑廠產品；鄰二氮菲，北京愛芳醫藥化工研制公司產品；過氧化氫，中國醫藥(集團)上�；瘜W試劑公司產品；三(羥甲基)氨基甲烷，成都科龍化工試劑廠產品。
　　1.2 材料地榆，購于南寧市國人大藥房。
　　1.3 儀器大孔樹脂HP-20，北京綠百草公司產品；紫外分光光度計，日本島津產品；恒溫水浴鍋，北京市醫療設備廠產品；微量移液器，上海精密儀器廠產品；冷凍液循環泵，鄭州長城科工貿有限公司產品；真空冷凍干燥系統，美國LABCONCO公司產品。
　　2 方法
　　2.1 提取分離方法取地榆500 g，采用60%乙醇,70℃提取，冷凍干燥得到粗提物A，粗提物依次用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取，并分別冷凍干燥得到樣B，樣C，樣D，以及萃余物水相E組分；用大孔樹脂HP-20對樣E進行分離,洗脫體積均為2 BV,流速:1 BV/h,長徑比:12∶1，收集水、10%乙醇、40%乙醇和70%乙醇4部分的洗脫液， 冷凍濃縮干燥分別得到樣F，樣G，樣H，樣I 4個樣品。
　　2.2 透明質酸酶抑制率實驗抗過敏活性檢測：Elson-Morgan 改良法［8］的方法進行測定，并計算各個樣品的抑制率。
　　2.3 抗氧化實驗
　　2.3.1 羥基自由基的測定［9］將樣品配成濃度為0.4 mg·ml-1的溶液，取3只試管，分別加入2 ml pH=7.4的磷酸鹽緩沖液，1 ml 1.5mmol·L-1的鄰二氮菲溶液，充分混勻后，再加入1 ml 1.5mmol·L-1 FeSO4溶液，每加1管立即混勻，然后向其中1支試管加入1 ml的溶液（每次所加的體積不同），混勻。另兩支試管分別為損傷管和未損傷管，
　　不加洗脫溶液，再分別加入0.02%的H2O2 1 ml，未損傷管不加H2O2，最后補充各管體積至8 ml。于37℃下保溫1 h，測在510 nm下的吸光度，重復兩次，計算其平均值。
　　OH的清除率（%）=［（A2-A1）/（A0-A1）］×100%
　　A0：未損傷管的吸光度；A1：損傷管的吸光度；A2：加樣品并扣除樣品空白后的吸光度。
　　2.3.2 過氧化氫清除實驗［10］清除過氧化氫能力的測定按文獻方法并加以改進，以pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制10 mmol·L-1H202溶液，取5 ml上述溶液加入5 ml樣品液（0.4 mg·ml-1），混勻后用紫外分光光度計測定其在230 nm處的吸光值A1，實驗中以不加樣品液的H2O2溶液吸光值為A0，以不加H2O2溶液的樣品溶液的吸光值為A2。
　　過氧化氫的清除率(％)=［A0-(A1-A2)］／A0×100%
　　2.3.3 DPPH清除實驗［11］分別取2 ml不同濃度的試樣液于試管中，加入 2×10-4mol·L-1的DPPH· 溶液2 ml，混合均勻，反應30 min后在517 nm處測定其吸光度，同時測定試樣空白以及不加試樣液的空白樣的吸光度。按下式計算其對DPPH· 抑制率：
DPPH·清除率（%）=［1－（A1－A2）/A0］× 100% 式中：A1=2 ml DPPH· 溶液 2 ml試樣液的吸光度；A2=2 ml試樣液 2 ml無水乙醇的吸光度； A0=2 ml DPPH· 溶液 2 ml無水乙醇的吸光度。
　3 結果
　　3.1 各提取物的透明質酸酶抑制率原花青素、兒茶素都具有強有力的抗氧化作用，抗過敏作用。從表1可以看出，樣A經溶劑萃取后得到樣E，樣E經大孔樹脂純化后得樣H，其透明質酸酶的抑制率分別為47.70%，62.00%，76.00%，逐步升高。樣H的活性超過兒茶素，且提取率相對于其他樣品是較高的，因此選擇A，E，H作為下面抗過敏與抗氧化作用量效分析的樣品。從羥基自由基清除率與過氧化氫清除率來看，樣H的清除率是所有提取物最高的，其自由基清除率接近于原花青素和蘆丁，大于維生素C和兒茶素；過氧化氫清除率接近于原花青素，大于蘆丁、維生素C、兒茶素。因此，樣H在本實驗中顯示了與原花青素相近的活性。

　　本實驗對樣品H進行了試管預測：①樣品H可以使明膠溶液產生沉

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