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探析不同品種葛根中葛根素及總黃酮的含量測定
摘要：目的建立不同品種葛根中葛根素及總黃酮的含量測定方法。方法采用RP-HPLC法，以甲醇-水（32∶68）為流動相，檢測波長為250 nm測葛根素含量；紫外分光光度法測柴葛、粉葛中總黃酮含量。結果葛根素峰分離度提高，峰形改善；葛根素0.204～2.04 μg范圍內與峰面積線性關系良好（r=0.999 9），回收率為98.7%(n=5)，精密度RSD=0.86%�？傸S酮濃度在4.08～16.32 μg/ml范圍內與吸收度線性關系良好（r=0.999 8)。結論該法靈敏、準確、簡便易行,重復性好,可用于中藥葛根藥材及飲片的質量控制。關鍵詞： 柴葛 粉葛 葛根素 總黃酮 高效液相色譜
葛根為豆科植物柴葛Pueraria lobata (Willd. )Ohwi 和甘葛藤Pueraria thomsonii Bent h. 的干燥根，前者習稱柴葛，甘葛藤習稱“粉葛”［1］，始載于《神農本草經》，味甘、辛，性平，具有增加腦及冠狀動脈血流量、降低血管阻力、收縮平滑肌、降血糖及解熱等多種功效［2］。民間用于治療傷寒、溫熱頭痛、煩熱消渴等癥，也是中醫常用的祛風解毒藥�，F代研究表明，葛根含葛根異黃酮，主要為葛根素(perarin) 、大豆苷(daidzin) 、大豆苷元(daidzein) 3種活性成分，其中葛根素是本屬的特征成分，也是主要成分，為了對葛根進行有效的質量控制，本實驗以葛根素為指標，以柴葛、粉葛藥材為對象，建立了高效液相色譜法測定其葛根素的含量方法，并采用紫外分光光度法對其中的總黃酮進行了含量測定，為柴葛、粉葛的藥材鑒定提供參考方法。
1 儀器與材料
1.1 儀器美國 Waters 公司600-2487高效液相色譜儀,Millenium數據處理系統;Waters2487紫外檢測器；島津UV-2401PC型紫外分光光度計；島津AY120型萬分之一電子分析天平；SB3200型超聲清洗器。
1.2 材料葛根素對照品：中國藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純；水為重蒸餾超純水；其它試劑均為分析純。柴葛產于安徽岳西，粉葛產于廣西。
2 方法與結果
2.1 HPLC法測定葛根中葛根素的含量
2.1.1 色譜條件色譜柱：Zorbax XDB-C18（4. 6 mm ×250 mm , 5 μm)；流動相∶甲醇-水（32∶68）；流速1 ml/min；檢測波長250 nm；柱溫22℃；進樣體積10μl。理論板數按葛根素峰計算不低于5000。在該色譜條件下，樣品中的葛根素與其它峰均能達到基線分離，保留時間在14.3 min左右，對照品與樣品的色譜圖見圖1。
圖1 對照品Ⅰ、柴葛索氏提�、�、粉葛索氏提取Ⅲ的HPLC色譜圖（略）
2.1.2 對照品溶液的制備精密稱取葛根素對照品5.1mg，甲醇定容于25 ml量瓶。分別移取0.5，1.0，2.0，2.5 ml于5 ml量瓶，水定容，與原液共同作為HPLC用對照品溶液。
2.1.3 供試品溶液的制備
熱回流提取法：精密稱取柴葛、粉葛粉末（過50目篩）各0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50 ml，稱重�；亓魈崛�30 min，放冷，稱重并以30%乙醇補足減失重量，搖勻過濾，取續濾液為供試品，待測。
索氏提取法：稱取柴葛、粉葛粉末各0.5 g, 精密稱定，以甲醇為提取劑提取4h，過濾，濃縮提取液并用甲醇定容于10 ml量瓶。超聲處理30min，取上清液以水定容于10 ml量瓶，待測。
2.1.4 線性關系考察取對照品溶液，按照“2.1.1”色譜條件進樣10 μl，葛根素進樣量X(μg)為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，其回歸方程為：Y= 3.507 6×106X 3.274 5×104，r = 0.999 9。結果表明，葛根素進樣量在0.204～2.04μg范圍內與峰面積線性關系良好，可用外標兩點法計算含量。
2.1.5 精密度考察在“2.1.1”項色譜條件下，吸取同一對照品溶液10 μl，連續進樣5次，測得峰面積，RSD=0.8%，表明進樣與峰面積積分的精密度良好。
2.1.6 重復性考察取同一批柴葛、粉葛樣品5份，按“2.1.3”項下的方法制樣后，以“2.1.1”項色譜條件進樣10 μl，測定葛根素的峰面積，按外標法計算含量，RSD=2.8%，表明分析方法重復性良好。
2.1.7 穩定性考察精密吸取對照品溶液10 μl，分別在0，1，2，4，8，12，24，48 h時進樣，在 “2.1.1”項下色譜條件下測定峰面積，其RSD值為1.4%。表明葛根素在室內正常條件下48 h內穩定，因此整個實驗過程可以在常溫不避光的條件下操作。
2.1.8 回收率考察精密稱取已知葛根素含量的同一樣品藥材粉末5份，20 mg/份，精密稱定后，每份加入濃度為0.204 mg/ml的對照品溶液2.5～3.3 ml，按“供試品溶液制備”項下操作，精密吸取10 μl，進樣，計算回收率。結果見表1。
表1 加樣回收率測定結果（略）
2.1.9 樣品測定按“供試品溶液制備”項下操作，制備各樣品溶液，精密吸取10μl，進樣，在所選色譜條件下測定，外標兩點法計算含量，結果見表2。
表2 樣品中葛根素測定結果（略）
2.2 紫外分光光度法測定葛根中總黃酮含量
2.2.1 線性關系考察精密稱取葛根素對照品5.1 mg，甲醇定容于25 ml量瓶。移取0.2，0.4，0.5，0.6，0.8 ml置于10 ml量瓶，水定容，為紫外測總黃酮用對照品溶液。
以溶液濃度為橫坐標,吸收度為縱坐標，得線性方程：Y = 0.078X 0.015 2，r=0.999 8。表明總黃酮濃度在4.08～16.32 μg/ml范圍時與吸收度線性關系良好。
圖2 葛根素峰光譜掃描圖譜（略）
2.2.2 供試品制備
方法1：分別稱取柴葛、粉葛4.5 g，置于圓底燒瓶，乙醇回流提取3次，40 ml/次，時間均為1 h。合并3次濾液并濃縮置25 ml量瓶，乙醇定容。取1 ml用乙醇定容于100量瓶，再取1 ml上清液于10 ml量瓶，水定容，待測。以1 ml乙醇加水定容于10 ml量瓶中為空白對照。
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