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腦憶源膠囊中黃酮類物質(zhì)含量測定
【摘要】
【目的】建立腦憶源膠囊中總黃酮和淫羊藿苷含量的測定方法。【方法】采用《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）中規(guī)定的方法，以蘆丁為對照品，采用紫外—可見分光光度法測定總黃酮含量，高效液相色譜（HPLC）法測定膠囊中淫羊藿苷含量，色譜柱:luna Cl8（2） 100R（150mm×4.6mm，5μm），流動相：乙腈—水（體積比為30∶70），流速：1.0mL/min，檢測波長：270nm。【結(jié)果】蘆丁在0～24.75μg /mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.9990，平均加樣回收率為102.29％，sR為1.34％（N＝5）；淫羊藿苷含量在6.9×10-2～4.83×10-1μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，r=0.9999，平均回收率為95.39％，sR為2.5%（N=5）。【結(jié)論】本研究所建立的方法能夠準(zhǔn)確測定腦憶源膠囊中黃酮類成分的含量。
【關(guān)鍵詞】 腦憶源膠囊/化學(xué)；總黃酮/分析；淫羊藿苷/分析；色譜法，高壓液相；分光光度法，紫外線
Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of total flavonoids and icariine in Naoyiyuan Capsules. MethodsWith rutin as reference，total flavonoids was determined by ultraviolet?spectrophotometer with the method which was recorded in Health Food Test and Evaluation Technological Specification（2003 edition）. The content of icariine in Naoyiyuan Capsules was detected by HPLC. The chromatographic separation was performed on Luna C18（2） 100R column（150mm×4.6mm，5μm） with mobile phase consisted of acetonitrile?water（30∶70） at a flow rate of 1.0 mL/min．The detection wavelength was set at 270 nm. ResultsRutin showed a good linear relationship at the range of 0～24.75μg/mL，r=0.9990，and the average recovery was 102.29% with RSD being 1.34%. Icariine had good linearity in the concentration range of 6.9×10-2~4.83×10-1 μg，r=0.9999．The average recovery was 95.39％ with RSD being 2.5%（N=5）．ConclusionThe method is simple and accurate，and it can be used for the determination of total flavonoids in Naoyiyuan Capsules．
Key words:NAOYIYUAN CAPSULES/chemistry；TOTAL FLAVONOIDS/analysis；ICARIINE/analysis；CHROMATOGRAPHY，HIGH PRESSURE LIQUID；
腦憶源膠囊是由補(bǔ)腎中藥巴戟天、淫羊藿為主，輔以枸杞子、山藥組成的保健食品，用于輔助改善記憶、緩解體力疲勞等癥狀。現(xiàn)代研究已證實該方中單味藥材含有豐富的黃酮類和糖類物質(zhì)［1］，具有增加腦血流量，促進(jìn)造血功能、免疫功能及骨代謝，抗衰老等功效［2］，可用于改善記憶力、緩解體力疲勞及抗衰老等［3-4］。由于糖類物質(zhì)無紫外吸收［5］，故本實驗選擇總黃酮和淫羊藿苷作為腦憶源膠囊的測定指標(biāo)，建立其含量測定方法。現(xiàn)報道如下。
1儀器與試藥
8453E型紫外可見分光光度計（美國 Agilent公司），天美液相色譜儀（LC2030型紫外檢測器、L?2200型進(jìn)樣器、LC2130型泵），ELO2116729型紫外分光光度計，BS110S電子天平（Sartorius 公司）。腦憶源膠囊樣品為自制（批號：20080624、20080819、20080916），蘆丁對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：100080?200306），淫羊藿苷對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號：0737?200111），聚酰胺粉（柱層析用，60~80目，浙江臺州市路橋四甲生化塑料廠），乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，甲醇、乙醇、苯均為分析純。
2方法與結(jié)果
2.1總黃酮的含量測定
2.1.1溶液的制備［6］
2.1.1.1蘆丁對照品溶液的配制稱取5.0mg蘆丁，加甲醇溶解制成50μg/mL的蘆丁溶液。
2.1.1.2供試品溶液的制備取腦憶源膠囊3粒（批號：20080819，平均裝量0.45g/粒），精密稱取內(nèi)容物粉末1.0g，加乙醇定容至25mL，搖勻后，超聲（500W，40kHz）提取20min；放置，吸取上清液1.0mL，于蒸發(fā)皿中，加1g聚酰胺粉吸附，水浴上揮去乙醇，然后轉(zhuǎn)入層析柱；先用20mL苯洗，苯液棄去，然后用甲醇洗脫黃酮，收集洗脫液約80mL，水浴濃縮，定容至25mL；此液于波長360nm處測定吸收值，代入回歸方程，計算試樣中總黃酮含量。
2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL比色管中，加甲醇至刻度，搖勻，于波長360nm處比色。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得直線回歸方程為Y=0.027 3X-0.010 2，R=0.999 0，線性范圍為0～24.75μg/mL。
2.1.3精密度試驗取蘆丁對照品溶液（14.85μg/mL），連續(xù)測定5次，結(jié)果其吸光度值的sR為0.46%，表明精密度良好。
2.1.4重復(fù)性試驗精密稱取供試品1.0g（批號:20080819），平行5份，制備供試品溶液，按2.1.2項下方法測定其吸光度值，結(jié)果其吸光度值的sR為 0.29%，表明該方法的重復(fù)性較好。
2.1.5穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液（批號:20080819），分別在0、15、30、45、60min時測其吸收度，結(jié)果其sR為0.05%，說明供試品溶液在60min內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.6加樣回收率試驗精密稱取已測含量的膠囊內(nèi)容物（批號:20080819），加入蘆丁對照品，按2.1.1.2項下制備方法進(jìn)行試驗，其平均回收率為102.29%，sR為1.34%，結(jié)果見表1。
表1加樣回收率試驗（略）
2.1.7供試品溶液的測定取3批腦憶源膠囊內(nèi)容物1.0g，精密稱定，按2.1.1.2項下方法進(jìn)行試驗，在360nm波長處測定吸光度值，代入回歸方程計算，3批膠囊的總黃酮平均含量為11.44mg/g，結(jié)果見表2。表23批腦憶源膠囊中總黃酮含量測定（略）
2.2淫羊藿苷的含量測定
2.2.1溶液的制備［7］
2.2.1.1對照品溶液精密稱取淫羊藿苷對照品，加甲醇溶解制成34.5μg/mL的溶液。
2.2.1.2供試品溶液取膠囊內(nèi)容物，精密稱取0.1g（批號：20080819），置具塞錐形瓶中，加體積分?jǐn)?shù)80％乙醇25mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)80％乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
2.2.1.3陰性樣品溶液取不含淫羊藿的陰性制劑樣品，按2.1.2項下方法制備陰性樣品溶液。
2.2.2檢測波長的選擇取按2.2.1項下方法制備的3種溶液，分別在200～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，結(jié)果顯示對照品溶液和供試品溶液均在270nm處有最大吸收，陰性溶液在270nm處無吸收，結(jié)果見圖1。
2.2.3色譜條件［8］色譜柱：Luna Cl8（2） 100R（150mm ×4.6mm，5μm），流動相：乙腈—水（體積比為30∶70），流速：1.0mL/min，檢測波長：270nm。以淫羊藿苷計算理論塔板數(shù)不低于6000。
2.2.4專屬性試驗在上述色譜條件下，分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液10μL進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，淫羊藿苷峰保留時間為5.89min，陰性樣品在淫羊藿苷峰位置無干擾峰，供試品中淫羊藿苷與其他組分分離完全，分離度為2.09，理論板數(shù)以淫羊藿苷峰計算為6057，結(jié)果見圖2。
2.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10、12、14μL ，按2.2.3項下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程：Y=132307X-10726，r=0.9999，結(jié)果表明淫羊藿苷在6.9×10-2～4.83×10-1μg呈良好的線性關(guān)系。
2.2.6精密度試驗精密吸取對照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定淫羊藿苷峰面積，結(jié)果峰面積積分值sR為0.95%（N=5），表明精密度良好。
2.2.7重復(fù)性試驗取同一批號樣品（批號：20080819）5份，按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣10μL測定，淫羊藿苷含量均值為3.96mg/粒，sR為2.7%，表明重復(fù)性良好。
2.2.8穩(wěn)定性試驗取2.2.1.2項下供試品溶液分別于0、4、8h進(jìn)樣，測定淫羊藿苷峰面積，結(jié)果峰面積積分值sR為0.59%（N=3），表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.9加樣回收試驗精密稱取5份已知含量的樣品（批號：20080819）約0.05g，精密加入淫羊藿苷對照品溶液1mL（0.49mg/mL），按2.2.1.2項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10μL測定，計算回收率，結(jié)果見表3。表3淫羊藿苷加樣回收率試驗（略）
2.2.10樣品測定精密稱取3批樣品各0.1g，按2.2.1.2項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10μL，依法測定淫羊藿苷的峰面積，照外標(biāo)一點法計算含量，結(jié)果見表4。表4腦憶源膠囊中淫羊藿苷含量測定（略）
3討論
目前改善記憶功能的國產(chǎn)保健食品中含中藥或植物藥組方者較少，僅舒腦口服液和腦輕松膠囊涉及，功效成分為總黃酮，但其制劑總黃酮標(biāo)示含量均在100mg/kg以下。本試驗測得腦憶源膠囊中總黃酮含量達(dá)11440mg/kg，淫羊藿苷含量達(dá)8520mg/kg。按劑量服用，每天總黃酮攝入量可達(dá)到60mg左右，為產(chǎn)品的藥效學(xué)研究奠定了輔助改善記憶功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。總黃酮的含量測定方法報道很多，目前收載入相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)的有3種方法：文獻(xiàn)［6］中收載的2種方法和藥典［7］中收載的方法。有學(xué)者［1］比較了上述3種方法對總黃酮含量測定的影響，表明文獻(xiàn)［6］中收載的“檢驗二法”最合理、簡便，因此本實驗選擇該法測定總黃酮的含量。
淫羊藿苷測定預(yù)試驗中， 對供試品溶液、陰性對照溶液、對照品溶液分別進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果顯示對照品和供試品均在270nm處有最大吸收，而陰性對照溶液在270nm處無吸收，因此選擇270nm作為檢測波長。以不同比例的乙腈—水為流動相進(jìn)行測定，確定乙腈—水的體積比為30∶70，淫羊藿苷峰型良好，各組分分離效果好，陰性樣品無干擾。
本研究所建立方法可準(zhǔn)確測定腦憶源膠囊中黃酮類成分的含量。
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