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PTTG、VEGFC 的表達(dá)及微淋巴管密度與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的
作者：尹秋偉 郭旭峰 胡國強(qiáng) 趙健 李希波【摘要】 目的 檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）、癌旁組織及肺良性病變組織中垂體瘤轉(zhuǎn)化基因（pituitary tumor transforming gene,PTTG）及血管內(nèi)皮生長因子?C(vascular endothelial growth factor，VEGF?C)的表達(dá)和微淋巴管密度(lymphatic microvessel density，LMVD)值，并探討三者間的相互關(guān)系。方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織中 PTTG、VEGF?C mRNA 和蛋白及 LMVD 的表達(dá)，分析 PTTG、VEGFC 及 LMVD 與 NSCLC 臨床病理特征的關(guān)系，以及 PTTG、VEGFC 和 LMVD 三者之間的相互關(guān)系。同時(shí)，對(duì)隨訪資料進(jìn)行生存分析，繪制生存率曲線，探討 PTTG、VEGF?C 對(duì)肺癌患者預(yù)后的影響。結(jié)果 PTTG、VEGF?C mRNA 和 LMVD 值在不同性質(zhì)的肺病變組織中的表達(dá)均有顯著性差異(P均＜0?05)，在不同年齡、性別、是否吸煙、腫瘤大小、組織學(xué)類型及分化程度間無顯著性差異(P均＞005)，在TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及預(yù)后組間有顯著性差異(P均＜005)。PTTG、VEGF?C 蛋白表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及預(yù)后組間有顯著性差異(P均＜005)。生存率曲線顯示 PTTG、VEGF?C 高表達(dá)者生存時(shí)間均短于低/無表達(dá)者(P=0030，0027，n=65)。PTTG 在肺癌組織中的表達(dá)與 VEGF?C、LMVD 密切相關(guān)，隨著 PTTG 強(qiáng)度增加，VEGFC 分級(jí)及 LMVD 值亦增加。結(jié)論 PTTG、VEGF?C 的過度表達(dá)促使腫瘤微淋巴管的生成，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。PTTG 和 VEGF?C 表達(dá)可作為判斷 NSCLC 生物學(xué)行為及肺癌患者預(yù)后的良好指標(biāo)，VEGF?C 有望成為肺癌抗淋巴管治療的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】 垂體瘤轉(zhuǎn)化基因；血管內(nèi)皮生長因子C；微淋巴管密度；實(shí)時(shí)熒光定量PCR
垂體瘤轉(zhuǎn)化基因(PTTG)是1997年〔1〕 被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)與細(xì)胞增殖、分化和凋亡有關(guān)的癌基因。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)C 被認(rèn)為是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一特異性新生淋巴管刺激因子,可促進(jìn)腫瘤微淋巴管生成及腫瘤細(xì)胞向區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。有研究〔2〕 顯示 PTTG 可通過促進(jìn) VEGFC 的過度表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。國內(nèi)外已報(bào)道 PTTG 在食管癌、胃癌和卵巢癌等多種腫瘤中高表達(dá)，但目前尚未見對(duì) PTTG 在肺癌中表達(dá)研究的報(bào)道。以往關(guān)于 VEGFC 的研究多為蛋白半定量分析，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合免疫組化應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中 PTTG、VEGF?C 的表達(dá)進(jìn)行精確定量分析，并檢測(cè)微淋巴管密度(LMVD)的表達(dá)情況,旨在探討它們與 NSCLC 臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
1 材料與方法
1?1 研究對(duì)象
收集65例 NSCLC 組織，均來自手術(shù)切除且經(jīng)病理科常規(guī)病理學(xué)檢查證實(shí)。男∶女為40∶25，年齡43～78（中位數(shù)58?8）歲。依據(jù)1997年新的修訂標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，其中Ⅰ期7例，Ⅱ期28例，Ⅲ期26例，Ⅳ期4例；按病理形態(tài)學(xué)分為鱗狀細(xì)胞癌36例，腺癌26例，大細(xì)胞癌3例；按分化程度分為高分化5例，中分化18例，低分化42例；按有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例。所有患者均為原發(fā)性 NSCLC，術(shù)前均未接受過化療或放療等任何治療。同時(shí)取65例配對(duì)的癌旁組織和20例肺良性瘤樣病變組織(包括結(jié)核球10例，錯(cuò)構(gòu)瘤4例，炎性假瘤4例，肺纖維組織細(xì)胞瘤1例，肺隱球菌感染1例)。癌旁組織為距腫塊邊緣5 cm以上的正常組織。肺癌組織和肺良性病變組織均取自腫塊中央非壞死部分。標(biāo)本經(jīng)10％甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋。65例患者無住院期間死亡，隨訪日期以患者手術(shù)日期起計(jì)算，術(shù)后隨訪至2006年5月。
1?2 實(shí)驗(yàn)用品
RNAiso Reagent、SYBR ExScriptTM RT?PCR Kit(DRR053S) 均購自TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其他各種化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。采用ABI PRISM 7000 實(shí)時(shí) PCR擴(kuò)增儀。兔抗人多克隆抗體 PTTG、VEGFC、VEGFR?3及免疫組織化學(xué)試劑盒PV9000均購自北京中山生物技術(shù)公司。
1?3 實(shí)驗(yàn)方法
1?3?1 實(shí)時(shí)熒光定量
1?3?1?1 總RNA的提取
每100 mg組織勻漿后，加入TRIzol Reagent 1 ml，然后加入0?2 ml氯仿，離心后吸取上清，加入05 ml異丙醇，離心沉淀后棄上清，75% 乙醇洗沉淀，DNase Ⅰ酶解可能殘余的基因組DNA。RNA 溶于DEPC 水，甲醛變性凝膠電泳，分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度。
1?3?1?2 cDNA的合成
反轉(zhuǎn)錄儀為 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司)。采用10 μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，4μl 溶解于去RNA酶的雙蒸水，05μl 隨機(jī)引物（100 μmol），2 μl 5×ExSciptTM Buffer，025μl ExSciptTMRTase（200 U/μl），025 μl RNA酶抑制劑（40 U/μl），05μl dNTP 混合物(各10 mmol)，加去RNA酶的蒸餾水至10μl。反應(yīng)條件：42 ℃15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）；95℃2 min（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）。
1?3?1?3 熒光定量PCR擴(kuò)增
引物：由TaKaRa公司提供的高特異性引物, PPTG 上游引物序列5′?CCTCAGATGAATGCGGCTGTTA?3′，下游引物序列5′?AGCTTCAGCCCATCCTTAGCAA?3′，擴(kuò)增片段為118 bp。VEGF?C 上游引物序列5′CAGCACGAGCTACCTCAGCAAG?3′，下游引物序列5′?TTTAGACATGCATCGGCAGGAA3′，擴(kuò)增片段為115 bp。熒光定量 PCR 儀為ABI PRIS
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