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大鼠內耳的解剖結構與內耳膜迷路獲取技術
掌握內耳膜迷路取材技術，是開展內耳病理學研究和組織化學研究以及分子生物學研究的必備手段，以下是小編搜集整理的一篇探究大鼠內耳解剖結構的論文范文，歡迎閱讀查看。
大鼠作為動物模型，被廣泛地應用于內耳研究中，包括化學制劑和重金屬的耳毒性研究，噪聲、沖擊波的損害性試驗，以及各種原因所致聽力損失的治療研究等。盡管各種實驗的內容和目的不同，但都不可避免地需要觀察和評估大鼠內耳的病理改變或者需要取出內耳膜迷路結合分子生物學檢查方法評判某些特定基因或特殊蛋白質的變化。因此，了解大鼠內耳結構、掌握大鼠內耳膜迷路取材技術是開展內耳研究的最基本訓練科目之一。本文重點介紹大鼠內耳的解剖結構及大鼠內耳膜迷路取材技術，以期與同道交流，并為初學者提供參考經驗。
1大鼠內耳的解剖結構
大鼠內耳位于顳骨內，其骨性外殼被稱為骨迷路(BonyLabyrinth)(圖1A)，內部包裹與骨迷路形狀相似的懸浮于外淋巴液中的膜迷路(MembranousLaby?rinth)(圖1B)。內耳可分為前部的耳蝸(Cochlea)和后部的前庭(Vestibule)兩部分。
1.1耳蝸
大鼠骨性耳蝸是一個中空盤旋2.2周的螺旋形骨管，其中心的蝸軸(modiolus)在大鼠正常頭位時指向前下方。為描述方便，我們暫且規定蝸尖朝上。蝸軸上呈螺旋狀發出的骨性螺旋板(osseousspirallami?na)自蝸底向頂部盤旋，向外與耳蝸基底膜(basilarmembrane)相接。在骨性螺旋板下方的蝸軸內部有一個類似螺旋式盤旋的骨管，稱為蝸軸螺旋管(Rothenthal'sCanal)，其內為螺旋神經節(spiralgan?glion)，包括神經元(SpiralGanglionNeurons,SGNs)、膠質細胞、耳蝸傳入和傳出神經纖維等(圖1C)。
SGNs可分為Ⅰ型和Ⅱ型。其中Ⅰ型SGNs約占傳入神經元總數的90-95%,Ⅱ型SGNs約占傳入神經元總數的5-10%[1,2].兩類傳入神經纖維和傳出神經纖維僅在穿出疆孔之前有施萬細胞包裹，進入基底膜耳蝸螺旋器(Cortiorgan)的傳入和傳出神經纖維均裸露不再有髓鞘包裹。其中Ⅰ型傳入神經末梢與內毛細胞(InnerHairCells,IHCs)建立突觸聯系，Ⅱ型傳入神經末梢與外毛細胞(OuterHairCells,OHCs)相接(圖3A)。進入IHCs下方的來自內橄欖核耳蝸束神經纖維的末梢與Ⅰ型傳入神經纖維建立突觸聯系但并不與內毛細胞直接接觸，而橫穿Corti隧道進入外毛細胞下方的耳蝸上隧道傳出神經纖維的末梢則與OHCs建立直接的突觸聯系。在一般情況下，一個內毛細胞與大約20個Ⅰ型螺旋神經節細胞的神經末梢相聯系，而一根Ⅱ型傳入神經纖維則與大約10個外毛細胞相聯系。因此不難根據毛細胞的數目對Ⅰ型螺旋神經節總數和Ⅱ型螺旋神經節總數做大致的推算[1,3].蝸軸螺旋管內所有神經纖維的另一端經螺旋管內側骨壁進入蝸軸中心匯聚成聽神經束，在內聽道的底部向內轉彎入顱。
由于外毛細胞的高度自耳蝸底回向頂回逐漸增加，內、外毛細胞的靜纖毛長度也相應變長，因此Cor?ti器的高度、寬度及質量在耳蝸的不同部位并不相同，其受力后形變的程度(其倒數即為勁度)自然也不相同。小鼠耳蝸Corti器的寬度從耳蝸底回向頂回逐漸變寬，但基底膜的寬度從耳蝸底回向頂回卻是逐漸變窄，這顯然與許多教科書中對耳蝸基底膜寬度描述明顯不同[6].大鼠耳蝸Corti器的寬度從耳蝸底回向頂回也是逐漸變寬，基底膜的寬度變化同樣是由寬變窄，但是并不像小鼠那樣明顯，這一點顯然既不同于教科書中對人類基底膜寬度變化的描述也不同于小鼠的基底膜寬度變化特征(圖2C)，因此，我們認為Corti器的寬度、勁度和質量才是造成耳蝸不同部位具有不同頻率響應的關鍵因素，而并不完全取決于基底膜的寬度。
1.2前庭
大鼠的前庭由前庭池(vestibularcavity)和半規管(semicircularcanals)組成。前者位于內耳中部，其外壁中部的卵圓窗(ovalwindow)被鐙骨底板及環韌帶封閉，上壁與上鼓室相隔，后壁與弓狀下窩相隔，內壁與后顱窩相隔，下壁參與構成巖骨底面顱底(圖1A)。在大鼠前庭池內側骨壁的前下方有一個扁平的球囊(saccule)，后上方為啞鈴狀的橢圓囊(utricle)(圖1D、2A)。球囊的下方靠外經聯合管(ductusreuni?ens)與蝸管相通，靠內經內淋巴管(endolymphaticduct)與內淋巴囊(endolymphaticsac)相通[7].開口于橢圓囊后壁下角的前庭導水管(vestibularaqueduct)也向內與內淋巴管匯合匯入內淋巴囊。在球囊的內側表面有一個處于矢狀面呈鉤形的球囊斑(maculasacculi)(圖2D、3B)，球囊斑的感覺上皮面對前庭池的外側壁，球囊斑的底部則緊貼前庭池的內側骨壁(圖1D)。在橢圓囊的上部有一個處于冠狀面呈扇形的橢圓囊斑(maculautriculi)(圖2D、3C)，橢圓囊斑感覺上皮面朝向后方(圖1D、2A)，其底面的神經纖維和毛細血管經上篩斑(superiormaculacribrosa)骨壁小孔通向顱內。在球囊斑和橢圓囊斑的表面均覆蓋著膠狀的耳石膜(otolithicmembrane)，耳石膜的表層覆蓋著結晶體樣的耳石層(otoconiallayer)。毛細胞的動纖毛和靜纖毛插入到耳石膜內，當頭位發生直線加速運動時，耳石膜因慣性與囊斑產生相對位移造成毛細胞的纖毛彎曲，感覺上皮因此而產生相應的神經沖動，從而產生身體直線加速運動的感覺[1,2].
大鼠的半規管位于前庭池后方。這三個相互垂直的呈2/3環的中空骨管分別是外半規管(lateralsemicircularcanal)、上半規管(superiorsemicircularcanal)和后半規管(posteriorsemicircularcanal)，三個半規管借5個開口與前庭池相通。外半規管向外側凸起，與水平面約成30°角，其壺腹端開口和單腳分別開口于前庭池外壁的上部和下部;上半規管垂直向上向后凸起，與水平面垂直，壺腹端開口于前庭池上壁的后部，上半規管的另一端與后半規管聯合構成總腳開口于前庭后壁中部的內角;后半規管向后向外凸起，與水平面幾乎平行，其壺腹端開口于前庭池下壁的內角，另一端與上半規管聯合形成總腳。
大鼠的三個骨性半規管及其周圍菲薄的骨壁共同圍成一個開口朝向顱內的球形空洞(圖1A)，內容小腦絨球葉。三個膜性半規管內充滿內淋巴液，并借結締組織小梁懸浮固定在充滿外淋巴液的骨半規管內。在三個膜性半規管凸側緣的壺腹內各有一個與半規管走向垂直的壺腹嵴。壺腹嵴的表面布滿感覺毛細胞，毛細胞的動纖毛(kinocilium)和靜纖毛(ste?reocilium)插入到壺腹嵴表面覆蓋的膠質終帽(cupu?la)[1,2].當動物體位發生旋轉運動時，與旋轉平面平行的半規管內的壺腹嵴終帽就會與壺腹嵴產生最明顯的相對位移，使毛細胞的纖毛隨著終帽偏轉并因此產生角加速運動的感覺。雖然大鼠的外半規管壺腹嵴與人類、猴、豚鼠等實驗動物同樣呈馬鞍形[3],但是大鼠的上半規管和后半規管壺腹嵴卻被從嵴中央13D-F)，這種結構到底具有什么特殊的生理學意義，目前尚不清楚。
大鼠前庭各個感受器的結構基本相同，分布在各個感受器表面的Ⅰ型或Ⅱ型感覺毛細胞的底層均為一層支持細胞(圖1D)。這些支持細胞形成了一道明顯的分界線，所有的前庭神經纖維在穿越支持細胞之前都脫去髓鞘才能進入到前庭感覺上皮區實現與毛細胞之間的突觸聯系。來自前庭神經元的具有大神經纖維特征的傳入神經末梢以高腳酒杯的形態特征將形似“細頸花瓶”的Ⅰ型毛細胞自底部一直包裹到頸部;具有小神經纖維特征的前庭神經末梢則僅在細胞底部與柱狀的Ⅱ型毛細胞形成突觸聯系[1,2].支配或接受前庭上半規管壺腹嵴、外半規管壺腹嵴、橢圓囊斑以及球囊斑鉤部的神經纖維均經上篩斑匯聚到前庭上神經束(圖1D)入顱，而支配或接受球囊斑主體部分和后半規管壺腹嵴的神經纖維末梢則分別經中篩斑和下篩斑匯聚到前庭下神經束(圖2B)。
另外，球囊和橢圓囊還有一個最大的不同在于橢圓囊斑感覺上皮周圍具有豐富的暗細胞群，而球囊內部卻沒有暗細胞(圖1D)。球囊因此而不能產生內淋巴液，只能依靠從連合管接受由血管紋分泌的來自蝸管的內淋巴液，其內淋巴液的吸收則也只能通過內淋巴管匯集到內淋巴囊，這可能就是形成內淋巴液縱向流動循環的主要原因。與內淋巴液縱向流動循環截然不同的是，橢圓囊囊壁上的上皮細胞中含有大量的暗細胞，因此橢圓囊及三個半規管內的內淋巴液分泌和吸收大都以輻射流循環的方式來完成，也就是說，在橢圓囊和三個半規管壺腹內的內淋巴液主要由周圍的暗細胞分泌也由這些暗細胞吸收，這可能就是為什么破壞內淋巴囊僅僅造成球囊和蝸管內積水但是卻不能造成橢圓囊和半規管積水的重要原因[7].
2大鼠內耳的解剖步驟
觀察大鼠內耳的病理變化通�？梢圆扇★D骨切片和膜迷路取材及鋪片兩種方式。顳骨切片方法能夠顯示動物內耳的立體結構，充分展示內耳深部結構各個終器之間的相對位置關系;既可以證明耳蝸和前庭毛細胞的病理學改變，也可以觀察位于螺旋管內的螺旋神經節細胞和位于上篩斑和中篩斑骨壁內側的前庭上神經元和前庭下神經元病變，而且還可以評估血管紋、半規管、內淋巴管及內淋巴囊內的病理學改變。膜迷路取材及鋪片方法除了能夠對各感覺終器提供全面完整地定量分析之外，還能為進一步應用分子生物學研究手段提供純粹的內耳實驗樣品，因此，膜迷路取材技術更有助于開展在基因水平和蛋白質水平上的研究[8-12].自1966年Engstrom重新提倡使用耳蝸鋪片技術以來[13],許多研究者對耳蝸鋪片技術進行了不斷改進。我們于1979年在戴樹宏老師最早在中國舉辦的耳蝸鋪片學習班學會了Engstrom的經典耳蝸軟鋪片技術，我們在此基礎上首先提出了改良耳蝸硬鋪片技術[14],隨后又拓展了耳蝸螺旋韌帶鋪片[15]和前庭各終器鋪片[16]乃至全內耳膜迷路鋪片等一系列耳蝸膜迷路取材技術[17].由于不同動物的內耳解剖結構存在著一定差異，因此大鼠內耳的取材步驟與豚鼠內耳膜迷路取材并不相同[3].
我們通過總結先前積累的實踐經驗，介紹兩種不同的大鼠內耳膜迷路取材及鋪片技術如下。
大鼠內耳取材技術可以分為不經脫鈣的膜迷路取材方法和經脫鈣的膜迷路取材方法。前者主要適用于內耳膜迷路基因轉染實驗中對轉染基因標記及轉化蛋白質的觀察、各種熒光免疫組織化學觀察、以及為各種分子生物學研究提供不同的內耳組織材料。后者雖然在顯微操作上相對容易，但由于脫鈣過程造成的酶蛋白失活和抗原抗體反應減弱或丟失以及染色標記褪色等問題，脫鈣后取材的方法大多僅適用于常規病理學檢查。根據不同的實驗需求和染色標記步驟，樣品染色或標記有時可能需要安排在組織固定之前有時需要安排在組織固定之后，這主要取決于標記信號是否需要進行活細胞標記以及標記物能否在脫鈣過程中保存。例如琥珀酸脫氫酶不能耐受醛類化學固定劑，因而應用四唑鹽法標記琥珀酸脫氫酶就必須對耳蝸施行先灌流染色然后再固定，由于四唑鹽法產生的酶組織化學藍色甲臜(formazan)沉淀物可以耐受脫鈣處理，因此適合應用脫鈣后取材的方法并按照軟鋪片的方法來制備樣品;然而經轉染后產生的綠色熒光蛋白以及各種探針熒光標記的蛋白質大多不能耐受脫鈣，它們或者會在脫鈣過程中喪失抗原抗體反應性，或者會在脫鈣過程中發生熒光信號的淬滅，因而對施行熒光免疫組織化學染色的樣品，我們主張采用不脫鈣的方法來制備樣品。
2.1硬鋪片法
將固定后的顳骨置于盛有蒸餾水的玻璃皿中。
在解剖顯微鏡下，用鑷尖刺破蝸尖骨壁，將分離針探入頂回螺旋韌帶與蝸殼之間并沿著螺旋韌帶的背側分離蝸殼，鼓室側蝸殼較薄，在確保蝸殼與螺旋韌帶完全分離后可以輕易摘除已分離的蝸殼;顳骨巖部側的蝸殼骨壁較厚，則需要先將螺旋韌帶與骨壁分離，然后再用剪刀剪除顳骨巖部側骨壁，直至暴露整個耳蝸膜迷路(圖4A、B)。用分離刀探入基底膜底面與骨性螺旋板之間的縫隙中，沿骨性螺旋板將基底膜從鼓階朝蝸管方向輕抬，使耳蝸基底膜與蝸軸分離，此過程可以從蝸尖開始逐漸向蝸底進行或者從蝸底開始向蝸尖推進。由于基底膜的表面沒有骨組織阻擋，分離開的基底膜朝著蝸管方向彎曲不會造成基底膜折斷，同時由于操作器械是從基底膜的背面向上抬，因此也不會造成Corti器的機械損傷。取出耳蝸膜迷路之后，可用顯微剪將螺旋韌帶剪除(圖5E)，也可以將基底膜的頂回、中回和底回分別切斷，然后再用分離刀沿著基底膜的外側緣將螺旋韌帶切下，最后用游絲鑷摘除覆蓋在Corti器表面的蓋膜(圖5F)并完成耳蝸基底膜鋪片(圖2C、3A)。
解剖前庭各個終器的方法是在摘除鐙骨底板后，沿著卵圓窗邊緣打開前庭池外壁充分暴露前庭池。在前庭池內壁前下方可見鉤形的球囊斑，在前庭池的后上方可見扇形的橢圓囊斑，由于這兩個囊斑的表面均覆蓋著白色的耳石膜使之成為兩個囊斑的最醒目標志，因此很容易辨認。橢圓囊斑和上半規管及外半規管壺腹均位于面神經管內側深部。需要先打開面神經管外側壁摘除面神經，再打開面神經管內側骨壁才能充分暴露橢圓囊的囊斑和兩個膜壺腹(圖4B)。球囊斑與前庭池內壁的附著較為緊密，需要用分離針探入球囊內側壁和骨壁之間進行分離，然后取下被分離的整個球囊。橢圓囊和上半規管、外半規管壺腹相對游離，與橢圓囊斑和外壺腹嵴及上壺腹嵴相聯系的神經纖維從上篩斑表面的小孔進入骨壁匯聚成前庭上神經束，因此只要將橢圓囊斑和兩個膜壺腹進入上篩斑的神經纖維和血管在上篩斑處截斷就可以將橢圓囊斑和外半規管及上半規管壺腹取下。后半規管壺腹的位置埋藏在蝸管底回hook后方的骨壁深部(圖2A、B)，需要撬開周圍骨壁方可暴露，然后將后壺腹通向下篩斑的神經纖維截斷即可將后壺腹完整取出。獲得所有前庭終器后，還需打開球囊和橢圓囊的囊膜并切除囊斑周圍多余的膜性組織，再用游絲鑷去除兩個囊斑表面覆蓋的耳石膜，使兩個囊斑表面的感覺毛細胞充分暴露。撕開三個膜壺腹充分暴露壺腹嵴，最后將囊斑和壺腹嵴的正面朝上鋪放在載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片(圖2D、3B-F)。
2.2軟鋪片法
經過脫鈣處理，骨組織中原先含有的鈣鹽基質被除去，由于原先堅硬的骨組織變成了軟組織，因此脫鈣后施行膜迷路取材的難度要比不脫鈣取材容易。將顳骨置于盛有蒸餾水的玻璃皿中，以類似不脫鈣分離的解剖手法，先分離蝸殼與螺旋韌帶，由于骨組織經脫鈣后已經變軟，分離時需要將分離針沿著蝸殼和螺旋韌帶之間的間隙進行分離，同時要注意防止撕扯骨壁，以免牽拉造成耳蝸變形而撕裂基底膜。暴露整個膜迷路后，用游絲鑷從聽神經孔取下蝸軸。再用游絲鑷和分離刀將整條耳蝸基底膜按底回、中回和頂回截成三個片段(圖5A-C)。用游絲鑷夾持蝸軸，再用分離刀沿著基底膜的內側緣切除蝸軸(圖5D)。然后用分離刀沿著基底膜與螺旋韌帶交界處插入，用游絲鑷沿著分離刀的刀刃將螺旋韌帶與基底膜分開(圖5E)。最后用游絲鑷摘除蓋膜(圖5F)并完成耳蝸基底膜鋪片(圖2C)。由于許多藥物造成的耳蝸毛細胞損害都表現出一個從耳蝸底回開始逐漸向耳蝸頂回擴展的病變模式[18-23],因此選自耳蝸基底膜上某一部位的照片并不能有效表達整個耳蝸的病理學改變特征。我們主張在放大400倍的光學顯微鏡下，以目鏡中長度單位為0.24毫米的顯微測微尺從耳蝸頂回向底回依次測量基底膜的長度并對逐個測微尺視野內的內外毛細胞進行計數，同時將計數結果輸入到計算機與大鼠耳蝸圖軟件中的正常值進行比較，從而建立全耳蝸毛細胞損失百分比的曲線分析圖。我們認為只有施行全耳蝸毛細胞計數并用耳蝸圖才能從定位和定量兩個方面真實反映全耳蝸各個不同部位毛細胞的損害程度[24-27].
采用和不脫鈣取材法相同的解剖分離手法充分暴露前庭各個終器并分離取下兩個囊斑及三個壺腹嵴，最后按類似不脫鈣取材相同的方法修剪前庭終器周圍的膜組織完成鋪片和觀察。許多藥物造成的前庭毛細胞損害也表現出一個從囊斑微紋區向周邊區擴展以及從壺腹嵴頂部向兩側擴展的病變模式[28,29],因此選自某一前庭終器的一張局部放大照片同樣不能有效表達前庭各個終器不同部位感覺上皮細胞的病理學改變特征。我們主張在高倍光學顯微鏡下，以框定的一個小視野做為測量前庭毛細胞密度改變的定量觀察指標。以球囊斑和橢圓囊斑鋪片為例，以微紋區幾個小視野測量數據的平均值來代表該微紋區的毛細胞密度，再以周邊區幾個小視野的平均毛細胞密度來反映周邊區的毛細胞病變程度。我們認為只有用毛細胞密度的表達方式才能從定位和定量兩個方面真實反映前庭各個終器不同部位毛細胞的損害程度[28-30].
3總結
掌握內耳膜迷路取材技術，是開展內耳病理學研究和組織化學研究以及分子生物學研究的必備手段，因為如果取不到內耳組織材料，上述研究都將無法進行。本文介紹了兩種不同的大鼠內耳膜迷路取材方法，實際上無論是不脫鈣取材還是脫鈣后取材，都需要建立在對大鼠內耳解剖結構了如指掌的基礎之上，對內耳結構的了解和熟悉顯然離不開在解剖顯微鏡下的實際操作練習。本文在介紹內耳膜迷路解剖分離技術的同時，著重談到顯微鏡下操作時每一步驟的具體操作方向、角度、力度及手法，我們希望這些來自實踐的經驗體會能為同道和初學者提供有益的技術幫助。本文還討論了如何對耳蝸和前庭毛細胞病變進行定量分析的合理建議。
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