- 相關(guān)推薦
兩種植物組織特異性基因表達(dá)方法分析
目前研究人員已經(jīng)在不同植物中分離并證實(shí)了多種具有組織表達(dá)特異性的啟動(dòng)子，以下是小編搜集整理的一篇相關(guān)論文范文，歡迎閱讀參考。
多細(xì)胞生物體內(nèi)存在不同類型的器官、組織、細(xì)胞，它們有各自的特性，擔(dān)負(fù)著不同的功能。例如，植物根表皮中的根毛細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)從周圍土壤中吸收水分與礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。與這一功能相適應(yīng)，它們?cè)诎l(fā)育過程中向外突起形成管狀結(jié)構(gòu)以增加其表面積和吸收水分、養(yǎng)分的能力(Grier-son和Schiefelbein2002);植物根里的內(nèi)皮層細(xì)胞在發(fā)育過程中通過特殊的細(xì)胞壁加厚和特定部位胼胝質(zhì)的沉積形成“凱氏帶”,阻止礦質(zhì)養(yǎng)分向維管束和地上部分滲透，控制皮層和維管柱之間的物質(zhì)運(yùn)輸;在莖和葉片中，保衛(wèi)細(xì)胞可以調(diào)節(jié)內(nèi)部葉肉細(xì)胞與外部環(huán)境之間的氣體交換，這一過程需要依賴周圍細(xì)胞通過K離子交換來創(chuàng)造一個(gè)調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉與打開的膨壓(Raschke和Fellows1971)。這些不同類型器官、組織、細(xì)胞的形成，以及它們之間功能的差異，在很大程度上取決于特異性表達(dá)的基因。因此，研究不同器官、組織、細(xì)胞中呈特異性表達(dá)的基因，對(duì)了解植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)理，細(xì)胞類型與功能之間的關(guān)系都有重要意義。
此外，研究組織特異性表達(dá)的基因的調(diào)控機(jī)理，可幫助我們構(gòu)建植物組織特異性表達(dá)體系，有目的地在特定器官、組織、細(xì)胞中表達(dá)特定靶基因，以便進(jìn)行靶基因功能分析。組織特異性表達(dá)技術(shù)在植物基因工程中具有一定的應(yīng)用前景，如利用植物的特定組織細(xì)胞合成所需要的代謝產(chǎn)物，還可以用于作物改良的基因工程等。組織特異性表達(dá)技術(shù)是近年來植物學(xué)研究中的一個(gè)重要領(lǐng)域(Ubeda-Tomas等2008;Plett等2010;Duan等2013)。
本文主要介紹目前被廣泛使用的兩種植物組織特異性基因表達(dá)方法，即特定啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)法和GAL4/UAS激活標(biāo)簽法。
1組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)法
1.1植物組織特異性啟動(dòng)子
啟動(dòng)子是一段位于功能基因5‘端上游的DNA序列，包含特定的保守序列，長(zhǎng)度因基因而異。啟動(dòng)子上的多種順式作用元件能識(shí)別RNA聚合酶，并指導(dǎo)相應(yīng)類型的RNA聚合酶與模板正確結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體，控制轉(zhuǎn)錄的時(shí)空特性和強(qiáng)度，從而精確有效地啟動(dòng)基因的表達(dá)。有些啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子(Odell等1985)、水稻Actin1基因的Act1啟動(dòng)子(McElroy等1990)和玉米Ubiquitin基因的Ubi啟動(dòng)子(Christensen等1992)等，其調(diào)控的基因不受時(shí)空及外界因素的影響，幾乎在植物所有組織都有表達(dá)，而且表達(dá)水平在不同組織部位沒有明顯差異，被稱之為組成型啟動(dòng)子或非特異性表達(dá)啟動(dòng)子。
組織特異性啟動(dòng)子，又稱為器官特異性啟動(dòng)子或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，則不同于組成型啟動(dòng)子，其所控制的基因只在或主要在特定的組織中表達(dá)。除具有一般啟動(dòng)子的特性外，組織特異啟動(dòng)子還具有一些調(diào)控目的基因特異表達(dá)的調(diào)控元件，這些調(diào)控元件的位置、數(shù)目、種類決定了目的基因表達(dá)的時(shí)空專一性，是基因特異表達(dá)所必需的。因此，組織特異型啟動(dòng)子已成為轉(zhuǎn)基因研究中常用的外源基因的啟動(dòng)元件。
目前研究人員已經(jīng)在不同植物中分離并證實(shí)了多種具有組織表達(dá)特異性的啟動(dòng)子，按照其驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)部位，可分為植物營(yíng)養(yǎng)器官，如根、塊莖、維管組織和莖葉綠色組織等表達(dá)的組織特異性啟動(dòng)子，植物生殖器官如花器、果實(shí)和種子表達(dá)的組織特異性啟動(dòng)子(表1)。根據(jù)調(diào)控的組織特異性基因表達(dá)模式是否受光、熱等條件的誘導(dǎo)，又可分為可誘導(dǎo)和無需誘導(dǎo)的組織特異性啟動(dòng)子，比如水稻綠色組織特異表達(dá)的Rca基因和LP2基因的啟動(dòng)子要受到光的誘導(dǎo)(Thilmony等2009;Yang等2012)。研究人員也發(fā)現(xiàn)，許多植物的內(nèi)含子也有調(diào)控基因時(shí)空表達(dá)的作用，例如擬南芥花同源基因AGAMOUS中內(nèi)含子中有增強(qiáng)子序列，它和該基因在花器官中的特異區(qū)域表達(dá)相關(guān)(Busch等1999)。水稻OsTubA1基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，在不同的組織如根尖、幼葉和花中有表達(dá)，而這一表達(dá)模式需要第一個(gè)內(nèi)含子的調(diào)控(Jeong等2000)。矮牽�；≒hADF1基因中第1個(gè)內(nèi)含子會(huì)增強(qiáng)其在維管組織的特異性高表達(dá)，后來研究證明，這一內(nèi)含子改變PhADF1基因組織特異性表達(dá)的過程是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，而且進(jìn)化比較保守(Mun等2002;Jeong等2007)。
1.2植物組織特異性啟動(dòng)子的一般研究方法
研究植物的啟動(dòng)子一般采用如下手段，首先通過PCR擴(kuò)增法，從植物基因組中擴(kuò)增已知全部或部分序列的啟動(dòng)子片段，然后通過PLACE(Higo等1999)和PLANTCARE(Lescot等2002)網(wǎng)站，對(duì)得到的啟動(dòng)子片段進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的核心結(jié)構(gòu)和功能，并在啟動(dòng)子片段的后面融合GUS和GFP等報(bào)告基因，通過瞬時(shí)和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化，對(duì)啟動(dòng)子的表達(dá)模式進(jìn)行分析，最后通過點(diǎn)突變、片段缺失等分析，得到該啟動(dòng)子的核心調(diào)控元件(Ellerstrom等1996;Li等2005;Konishi和Yanagisawa2010)。
cDNA微陣列的數(shù)據(jù)給開發(fā)新的啟動(dòng)子提供了有利條件。Ye等(2012)人利用水稻cDNA微陣列數(shù)據(jù)庫(kù)CREP(CollectionofRiceExpressionProfiles,http://crep.ncpgr.cn)，鑒定得到一個(gè)只在綠色組織中特異表達(dá)的基因，與水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因編碼一個(gè)蛋白DX1.RT-PCR分析表明，DX1確實(shí)是在葉、葉鞘、莖和穗莖中表達(dá)，而在根、花藥和胚乳中都沒有表達(dá)。通過將編碼區(qū)上游1505bp和下游558bp序列作為該基因的候選啟動(dòng)子，并提交到PlantCARE網(wǎng)站與已有數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，采用片段缺失分析和凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)EMSA(ElectrophoreticMobilityShiftAs-say)，得到位于–71至–61的序列5'CAGGACATATT3'(GSE1)和位于+1至+86的5'ATGAACTCAAA-GAGCC3'(GSE2)的2個(gè)綠色組織特異的順式調(diào)控元件。點(diǎn)突變分析表明這兩個(gè)順式調(diào)控元件都是正調(diào)控因子。
近些年來，由于基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)和測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，使得大規(guī)模預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列和找到發(fā)揮作用的調(diào)控原件變得可行。Verelst等人(2007)通過分析擬南芥花粉的4個(gè)發(fā)育階段中不同組織的ATH1基因芯片結(jié)果，找到了很多花粉特異表達(dá)的基因，啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)約22.9%的TCP-MPG類基因啟動(dòng)子中含有一個(gè)MEF2基序。差異基因表達(dá)也常被用來研究組織特異的啟動(dòng)子，通過cDNA-AFLP(cDNA擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性)，得到具有差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄片段，通過這種方法，在馬鈴薯中得到了一個(gè)具有在塊莖和匍匐莖等莖組織特異表達(dá)的StCCS啟動(dòng)子(Trinade等2003)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也有助于非模式物種的差異基因表達(dá)研究，Geng等(2014)通過在花生中建立一個(gè)基于高通量測(cè)序的篩選系統(tǒng)，獲得584條根特異和316條種子特異表達(dá)的基因片段，其中的55.3%和64.6%經(jīng)半定量RT-PCR驗(yàn)證為組織特異表達(dá)基因，并從中分離鑒定了一個(gè)根特異表達(dá)的啟動(dòng)子Asy.
1.3植物組織特異性啟動(dòng)子的應(yīng)用
目前，植物基因工程中使用的多是組成型啟動(dòng)子，其中CaMV35S啟動(dòng)子主要用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，Ubi啟動(dòng)子主要用于單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。雖然這類啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因在轉(zhuǎn)基因植物的不同組織、不同生長(zhǎng)階段均有高水平表達(dá)(Ranjan等2011;Park等2012)，也易于構(gòu)建目的基因過表達(dá)的載體，但在應(yīng)用中逐漸暴露出一些問題和局限性。例如，組成型的啟動(dòng)子不能用于研究不同類型細(xì)胞和組織的功能，而且靶基因在發(fā)育過程的錯(cuò)誤時(shí)間和錯(cuò)誤空間過量表達(dá)有時(shí)會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響(Potenza等2004)。組成型的基因表達(dá)可能會(huì)造成轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)延緩，開花延遲，減產(chǎn)，品質(zhì)降低，甚至不育等現(xiàn)象(Kasuga等1999和2004;Pino等2007)。此外，在同一個(gè)植物中重復(fù)使用同一個(gè)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)多個(gè)不同基因表達(dá)容易造成基因沉默現(xiàn)象(Palauqui等1996;Vaucheret等1998;Galili和Hofgen2002;Lessard等2002)。
組織特異性啟動(dòng)子則可克服上述缺點(diǎn)，它們可以驅(qū)動(dòng)外源基因在植物發(fā)育過程中某一特定的時(shí)空表達(dá)，使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在特定細(xì)胞或組織中積累(Jeong等2010)。伸展作用因子(expan-sin)是調(diào)控植物生長(zhǎng)過程中細(xì)胞壁伸長(zhǎng)的主要調(diào)節(jié)因子。在煙草中用擬南芥根系特異表達(dá)的啟動(dòng)子Pyk10(Nitz等2001)驅(qū)動(dòng)β型伸展基因TaEXPB23,不僅增加了側(cè)根的數(shù)目，而且與35S組成型啟動(dòng)子表達(dá)該基因的植株和野生型相比，根系生物量明顯提高;在缺水脅迫條件下，與野生型相比，根系特異表達(dá)該基因的植株光合速率增加，積累的活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)更少，具有較高水平的抗氧化酶的活性，使轉(zhuǎn)基因植株的抗脅迫能力提高(Li等2015)。植物發(fā)達(dá)的根系會(huì)增加其抗脅迫能力。水稻根系特異表達(dá)的RCc3啟動(dòng)子的分離給提高作物抗脅迫能力和作物產(chǎn)量提供了有效工具(Xu等1995)。Jeong等(2010)用RCc3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)水稻受干旱、高鹽和脫落酸等脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的OsNAC10基因，使其在根中過量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因水稻根直徑是非轉(zhuǎn)基因水稻的1.25倍，根的中柱、皮層和表皮都變大;在干旱脅迫和正常條件下，水稻產(chǎn)量與野生型相比都有不同程度的提高。
油菜是世界上廣泛種植的油料作物，含有高不飽和的C18脂肪酸和低芥酸，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。Ellerstrom等(1996)從油菜中分離得到一個(gè)只在胚和胚乳特異表達(dá)的啟動(dòng)子napA.利用napA驅(qū)動(dòng)調(diào)控不飽和脂肪酸合成的LEC1和L1L基因，使它們?cè)诜N子中特異表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株種子含油量提高2%~20%,但油分品質(zhì)沒有發(fā)生明顯改變，也沒有影響其他主要的農(nóng)業(yè)性狀，而且這些改良與作物生長(zhǎng)條件無關(guān)(Tan等2011)。
木質(zhì)素是一類酚類次生代謝產(chǎn)物，在植物體內(nèi)行使重要的生理功能，但對(duì)于造紙工業(yè)而言是有害成分，必須從木纖維中去除，木材中的木質(zhì)素是形成造紙污染的主要來源。編碼咖啡酸酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(caffeicacidO-methyl-transferase,COMT)相關(guān)基因的克隆，使研究者可以下調(diào)楊樹中COMT的含量，通過RNAi可以減少轉(zhuǎn)基因楊樹中約90%COMT活性，木質(zhì)素的含量沒有受到影響，但使木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，轉(zhuǎn)基因楊樹更加適用于紙漿工業(yè)(Lapierre等1999)。在煙草中用組成型啟動(dòng)子35S表達(dá)木質(zhì)素合成途徑相關(guān)基因肉桂酰輔酶A還原酶(cinnamoyl-CoAreductase,CCR)反義基因雖然可以下調(diào)CCR基因的表達(dá)，減少木質(zhì)素的含量，但也會(huì)影響整個(gè)植株的生長(zhǎng)發(fā)育，出現(xiàn)延遲生長(zhǎng)，皺葉等表型;為了克服這樣的困難，用維管組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子LlCCR和LlCAD可能會(huì)避免對(duì)整個(gè)植株造成的傷害，從而實(shí)現(xiàn)特異性地降低木材中木質(zhì)素的含量，減少造紙工業(yè)中為去除木質(zhì)素而消耗的能源和化學(xué)原料(Prashant等2011,2012)。
2 GAL4/UAS激活標(biāo)簽法
2.1GAL4/UAS系統(tǒng)簡(jiǎn)介
GAL4/UAS雙因子反式激活體系介導(dǎo)的基因異位表達(dá)可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的空間控制，加上適當(dāng)?shù)男揎椏梢詫?shí)現(xiàn)時(shí)空雙重控制。Brand和Perrimon(1993)首次在果蠅中構(gòu)建GAL4/UAS體系，建立了一個(gè)可將任何外源基因以果蠅自身細(xì)胞或組織特異的方式被選擇性激活表達(dá)的系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)來研究果蠅even-skipped蛋白的功能。Guyer等(1998)將修飾過的GAL4/UAS系統(tǒng)GAL4/C1首次運(yùn)用到雙子葉模式植物擬南芥中，在植物中建立了GAL4/UAS外源基因異位表達(dá)系統(tǒng)(圖1)。
GAL4/UAS是由酵母的GAL4基因和GAL4基因的上游激活因子序列UAS兩部分組成。GAL4/UAS系統(tǒng)的建立，首先需要將GAL4基因與組織特異性的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子相連接，建立以細(xì)胞和組織特異性的方式調(diào)控表達(dá)的GAL4轉(zhuǎn)基因系;同時(shí)將UAS與感興趣的靶基因融合，建立帶有UAS-靶基因的轉(zhuǎn)基因系。在UAS-靶基因轉(zhuǎn)基因系中，靶基因只需和UAS序列相連接，不再需要特定的啟動(dòng)子。因?yàn)镚AL4蛋白只能與UAS相結(jié)合之后才能調(diào)控GAL4基因的表達(dá)，所以只有將2個(gè)轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行雜交，在雜交后代中，特異性表達(dá)的GAL4才能以同樣的方式調(diào)節(jié)UAS-靶基因的表達(dá)(Brand和Perrimon1993)。
為了便于檢測(cè)GAL4/UAS系統(tǒng)雜交子代中靶基因表達(dá)的位置，通常采用的方式為運(yùn)用GUS和GFP等報(bào)告基因建立UAS-靶基因-報(bào)告基因，將靶基因的編碼區(qū)域與報(bào)告基因融合，整合到宿主的基因組中;此UAS轉(zhuǎn)基因系與GAL4系雜交后，子代中報(bào)告基因由于GAL4與UAS的結(jié)合，伴隨著靶基因開始表達(dá)，通過檢測(cè)報(bào)告基因在不同細(xì)胞中的活性，就可方便地對(duì)靶基因的表達(dá)模式進(jìn)行更為準(zhǔn)確的分析，再對(duì)其表達(dá)產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)做進(jìn)一步的研究(Wu等2003)。此外，為了方便在建立的GAL4系親本中提前檢測(cè)GAL4在不同細(xì)胞組織中的表達(dá)，可將報(bào)告基因GUS或GFP融合到GAL4片段后，隨著GAL4隨機(jī)的插入受體植物基因組中，由于和它鄰近的基因表達(dá)位置的不同，就可以得到標(biāo)記了綠色熒光蛋白的表達(dá)GAL4基因的株系(Laplaze等2005)。
2.2植物GAL4/UAS體系的建立
2.2.1擬南芥中GAL4/UAS體系構(gòu)建及應(yīng)用Haseloff(1999)發(fā)現(xiàn)由于GAL4序列中存在高A/T含量，這些序列會(huì)影響植物中mRNA的加工，使GAL4不能在擬南芥中表達(dá)。為了解決這一問題，他們用VP16代替GAL4中的激活部位，建立了一個(gè)高A/U含量的GAL4-VP16體系，使得其在植物前mRNA拼接過程中起到很好的識(shí)別內(nèi)含子的作用，從而在擬南芥中高效表達(dá)。GAL4-VP16隨機(jī)插入到擬南芥基因組中，其表達(dá)依賴于與它鄰近的基因增強(qiáng)子序列。為了檢測(cè)GAL4-VP16的表達(dá)，他們還將mGFP5基因融合到這段插入片段中，由于和它鄰近的基因表達(dá)位置的不同，這樣就得到標(biāo)記了綠色熒光蛋白的表達(dá)GAL4基因的不同細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，篩選收集到了250株只在擬南芥根尖不同細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的GAL4株系(圖2)。
后續(xù)研究者可以將感興趣的目標(biāo)基因融合到UAS編碼框后，得到UAS-目標(biāo)基因系，通過與這些GAL4-VP16系雜交，或者用UAS-目標(biāo)基因農(nóng)桿菌，直接轉(zhuǎn)化GAL4-VP16系，獲得在根尖不同細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)目的基因的子代，有利于更精確地研究目的基因的功能。除上述最初篩選到的250個(gè)株系外，其他研究者還從Haseloff等建立的GAL4-VP16株系中篩選到了新的組織特異性表達(dá)株系，如Laplaze等(2005)篩選得到401株在側(cè)根不同發(fā)育階段特異性表達(dá)的株系;Gardner等(2009)篩選得到了4株在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞特異表達(dá)的株系，并發(fā)現(xiàn)其中大部分只在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞表達(dá)，且其表達(dá)特異性不受外界環(huán)境變化。
這些制備并經(jīng)過驗(yàn)證的細(xì)胞和組織特異表達(dá)的GAL4-VP16株系為研究植物信號(hào)傳導(dǎo)及其作用機(jī)制提供了有效工具。赤霉素(gibberellin,GA)可以通過促進(jìn)擬南芥根中細(xì)胞的有絲分裂來調(diào)節(jié)分生組織大小，進(jìn)而調(diào)控根細(xì)胞的伸長(zhǎng)，維持根生長(zhǎng)。為了確定GA是通過分生區(qū)中哪些細(xì)胞來控制根細(xì)胞的增殖，Ubeda-Tomas等(2008,2009)利用上述Haseloff等建立的在不同根組織中表達(dá)的GAL4-VP16株系，包括J0571(在皮層和內(nèi)皮層表達(dá))、Q2500(內(nèi)皮層)、J0631(根伸長(zhǎng)區(qū))和J2341(根柱干細(xì)胞)，使突變基因GAI在這些組織中特異性表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在柱干細(xì)胞和伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞中表達(dá)GAI后，分生組織大小與野生型一樣;而在皮層或內(nèi)皮層中表達(dá)GAI則導(dǎo)致分生組織明顯變小，從而說明GA是通過促進(jìn)內(nèi)胚層中細(xì)胞的增殖來控制根分生組織的大小，控制根的生長(zhǎng)。同樣Duan等(2013)利用Haseloff等建立的株系研究高鹽脅迫對(duì)擬南芥幼苗側(cè)根的抑制作用中的細(xì)胞特異性。他們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)ABA參與這一抑制作用。為了驗(yàn)證ABA的這一調(diào)控是否具有組織特異性，作者首先利用上述Haseloff等建立的在不同根細(xì)胞中表達(dá)的GAL4/UAS株系，特異表達(dá)能引起ABA不敏感的突變基因abi1-1,發(fā)現(xiàn)在這一調(diào)控中ABA信號(hào)傳導(dǎo)主要在內(nèi)皮層和皮層;然后他們進(jìn)一步利用內(nèi)皮層和皮層特異表達(dá)的啟動(dòng)子，鎖定了內(nèi)皮層為ABA信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵場(chǎng)所。
Haseloff等建立的組織特異性表達(dá)株系也被用來研究植物對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)機(jī)理。如Moller等(2009)利用在擬南芥根中細(xì)胞特異性表達(dá)的GAL4/UAS株系研究鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的組織特異性表達(dá)對(duì)植物抗鹽性的影響。作者選用兩種在根和中柱中穩(wěn)定表達(dá)的GAL4株系，J2731(只在主根和側(cè)根的中柱鞘表達(dá))和E2586(在主根和側(cè)根的維管柱和中柱表達(dá))，使HKT基因在這些細(xì)胞中特異表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在根中柱細(xì)胞中表達(dá)HKT1.1會(huì)增強(qiáng)鈉離子流入的能力，減少鈉離子從根中到莖中的轉(zhuǎn)移，并導(dǎo)致莖中鈉離子濃度降低，使植物的抗鹽能力增強(qiáng)。Plett等(2010)用在表皮和皮質(zhì)細(xì)胞層特異表達(dá)的GAL4株系發(fā)現(xiàn)在擬南芥根表皮和皮層特異表達(dá)HKT1.1會(huì)增加莖中鈉離子的積累。
2.2.2水稻GAL4/UAS體系構(gòu)建及應(yīng)用Wu等(2003)在水稻’中花11‘和’中花15‘中建立了GAL4-VP16/UAS體系，將經(jīng)過修飾的GUS報(bào)告基因(GUSPluse)放在6×UAS啟動(dòng)子上，用來檢測(cè)基因在不同位置的表達(dá)，得到了約31443株F1代有GUS標(biāo)記的單株(表2)。通過用GAL4/VP16編碼區(qū)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和GAL4/VP16特異探針進(jìn)行核酸雜交驗(yàn)證，大部分F1代GAL4株系都有T-DNA插入，其中約有一半為單拷貝插入。由于GUS標(biāo)記需要經(jīng)過組織化學(xué)染色、固定等步驟才能確定表達(dá)位置。Johnson等(2005)以GFP為報(bào)告基因，得到具有不同表達(dá)強(qiáng)度的GFP轉(zhuǎn)化株，在水稻中建立了一個(gè)可快速、跟蹤檢測(cè)的GLA4/UAS系統(tǒng)。Plett等(2010)利用Johnson等人建立的水稻GAL4-GFP系統(tǒng)中在木質(zhì)和皮層有GFP特異表達(dá)的AGF03和AOHB03株系，將擬南芥HKT1.1基因在這些GAL4系中特異表達(dá)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)用鹽脅迫處理時(shí)，與對(duì)照相比，水稻皮層中特異表達(dá)HKT1.1的轉(zhuǎn)化株(AOHB03)干重明顯增加，根中鈉離子增加，莖中鈉離子濃度變低;而木質(zhì)部中HKT1.1的特異表達(dá)轉(zhuǎn)化株(ASGF03)干重減輕，莖中鈉離子濃度升高，而根中降低。這些結(jié)果與在擬南芥中得到的結(jié)果相同，說明鈉離子在特定細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)與植物抗鹽性間的關(guān)系在擬南芥和水稻中非常相似。可見組織特異性表達(dá)這一研究工具在糧食作物的重要農(nóng)藝性狀研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。
3討論與展望
雖然現(xiàn)在已經(jīng)分離得到了許多細(xì)胞或組織特異的啟動(dòng)子，但對(duì)于多細(xì)胞和組織器官?gòu)?fù)雜的高等植物來說，還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，而且啟動(dòng)子具有物種特異性，在不同物種中其驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)位置可能存在差異。目前，由于轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，給分離更多的特異性啟動(dòng)子提供大量數(shù)據(jù)，尤其是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析可以幫助我們更快的認(rèn)識(shí)基因在時(shí)間和空間的表達(dá)模式，進(jìn)而開發(fā)更多新的有用的特異性啟動(dòng)子(Po-tenza等2004;Shelenkov和Korotkov2009)，實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因表達(dá)的定時(shí)、定點(diǎn)、定量三維精確調(diào)控，使其在可控條件下為基礎(chǔ)研究和作物性狀改良創(chuàng)造更多可能(Jeong等2010;Ye等2013;Li等2015)。
由于GAL4-UAS系統(tǒng)在建立時(shí)GAL4基因是隨機(jī)插入基因組的，這就使它存在不可避免的缺點(diǎn)：(1)單一株系在多個(gè)不同細(xì)胞和組織中都有目的基因的表達(dá);(2)這種多細(xì)胞表達(dá)的組合是隨機(jī)的，強(qiáng)弱不同，不是研究想要的組合;(3)得到的不同組織特異的GAL4群體可能不能完全包含研究所需要的全部細(xì)胞類型。因此，在研究特定基因的功能或信號(hào)響應(yīng)和應(yīng)答的特異組織定位時(shí)，不僅需要篩選分離和驗(yàn)證更多細(xì)胞或組織特異的啟動(dòng)子，建立和擴(kuò)大組織特異的GAL4/UAS群體，優(yōu)化得到有規(guī)律或?qū)嶒?yàn)所需的細(xì)胞表達(dá)組合，還要將組織特異的啟動(dòng)子和GAL4/UAS株系結(jié)合起來，利用各自特點(diǎn)先通過在多個(gè)不同細(xì)胞和組織中都有目的基因表達(dá)的GAL4/UAS株系，將信號(hào)響應(yīng)目標(biāo)細(xì)胞定位到很小的區(qū)間(一到兩種細(xì)胞類型)，再通過已知的細(xì)胞特異的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因在其表達(dá)，最終將響應(yīng)特定信號(hào)的細(xì)胞類型確定下來。
目前文獻(xiàn)中報(bào)道和廣泛使用的GAL4/UAS系統(tǒng)大多是以果蠅(Brand和Perrimon1993)、老鼠(Mallo2006)、斑馬魚(Halpern等2008)、擬南芥(Haseloff1999)和水稻(Wu等2003)等模式生物建立的，主要用于研究特定基因的功能或者信號(hào)響應(yīng)的特異組織定位，或者在特定細(xì)胞或組織中表達(dá)致死的基因，達(dá)到切除靶細(xì)胞的作用(Brand和Per-rimon1993)。隨著測(cè)序技術(shù)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的進(jìn)步，使得GAL4/UAS技術(shù)日益成熟，我們有望在更多的動(dòng)植物中建立這種細(xì)胞和組織特異表達(dá)的庫(kù)，用于改良作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，疾病治療等。
【兩種植物組織特異性基因表達(dá)方法分析】相關(guān)文章：
小鼠不同部位骨髓組織病理切片分析09-12
基于組織行為學(xué)分析沃爾瑪企業(yè)文化05-01
論先秦貨幣的兩種體系05-31
乙酰膽堿基因工程與生命工程06-04
淺析組織公道的維度08-24
制度質(zhì)量與組織生命06-01
認(rèn)識(shí)“業(yè)務(wù)分析”08-25
住房裝修分析05-11