- 相關(guān)推薦
關(guān)于山藥組織培養(yǎng)褐化反應(yīng)的研究
論文關(guān)鍵詞:山 組織培養(yǎng) 外植體 褐化 抗氧化劑 培養(yǎng)基質(zhì)
論文摘要:筆者從山藥不同外植體(葉、莖段、零余子)、培養(yǎng)基中添加抗氧化劑和不同培養(yǎng)基質(zhì)3個(gè)方面進(jìn)行試驗(yàn)研究。結(jié)果表明,山藥不同外植體的褐化程度也不一樣,莖段褐化程度最輕;MS培養(yǎng)基中添加150mg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)能有效抑制外植體的褐化;在山藥組培苗的快繁階段采用液體基質(zhì)培養(yǎng)方式能顯著降低褐化程度,提高山藥組培苗成活率。
山藥(Chinese yam)具有較高的藥用價(jià)值及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，主要食用器官為地下塊莖，為大眾化的滋補(bǔ)食品，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可進(jìn)行快速繁殖，而且能使優(yōu)良品種種性得以保存延續(xù)[1,2]。但山藥在組織培養(yǎng)過(guò)程中存在著嚴(yán)重的褐化發(fā)應(yīng)，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)山藥組培苗或外植體枯死及其基部培養(yǎng)基顏色黑褐化，這種褐化現(xiàn)象又稱為酚污染，嚴(yán)重影響外植體的脫分化和培養(yǎng)物的再分化[3]。因此，為了山藥組織培養(yǎng)工廠化育苗的順利進(jìn)行，筆者就山藥組織培養(yǎng)過(guò)程中的褐化現(xiàn)象及有效控制等方面進(jìn)行了研究探討。
1與方法
1.1材料
供試材料為寸金薯葉片、莖段、零余子等常用組培外植體為材料[2]，山藥品種寸金薯來(lái)自福建龍巖大池鎮(zhèn)。
1.2方法
1.2.1不同外植體褐化反應(yīng)研究觀察從生長(zhǎng)植株上取其幼嫩莖節(jié)間部莖段、完全伸展的葉片及結(jié)出的零余子為外植體，先將外植體用自來(lái)水反復(fù)沖洗后，在無(wú)菌條件下，用70%酒精消毒20~30s，再放入2%次氯酸鈉溶液中消毒10~15min，再用無(wú)菌水漂洗3~4次，最后將外植體切成大小適合的小塊接種在已配好的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)[1,2,4]。葉片大小為0.3~0.5cm方形，莖段（含節(jié)間）0.6~0.8cm，零余子切成0.5~0.6cm左右大小的方塊，瓊脂0.7%，PH值為5.8，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度為2000lx，每天光照時(shí)間16h。共3種處理，每種處理30瓶，每瓶一個(gè)外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)30d后觀察外植體褐化程度。
1.2.2不同外源物質(zhì)(抗氧化劑)對(duì)外植體褐化的抑制作用以山藥含節(jié)間部的莖段(0.6~0.8cm)為外植體，經(jīng)滅菌處理后，接種在以下3種處理的MS培養(yǎng)基(PH=5.8)中進(jìn)行培養(yǎng)：A：MS+150mg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，B：MS+80mg/L半胱氨酸[5,6]，C：MS+0.1%活性炭，每處理30瓶，每瓶一個(gè)外植體，重復(fù)3次，觀察外植體的褐化情況。
1.2.3不同培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)外植體褐化的影響以山藥莖段愈傷組織分化出的組培苗為外植體，分別接種在MS+0.7%瓊脂（固體培養(yǎng)）和未加瓊脂的MS培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)）中進(jìn)行快繁培養(yǎng)，每處理30瓶，每瓶一個(gè)外植體，重復(fù)3次，觀察其在快繁過(guò)程中的褐化情況。
2結(jié)果與分析
2.1不同外植體的褐化反應(yīng)
由此次試驗(yàn)結(jié)果可知，利用山藥不同外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，其褐化的程度也不同。當(dāng)外植體為含節(jié)間的莖段時(shí)，其褐化程度最輕，當(dāng)外植體為切成小方塊的零余子時(shí)，褐化現(xiàn)象最嚴(yán)重，葉片的褐化程度居中。表1為此次試驗(yàn)觀察，由表中的原始數(shù)據(jù)可看出，零余子褐化程度極其嚴(yán)重，在試驗(yàn)觀察過(guò)程中發(fā)現(xiàn)采用零余子小塊為外植體的培養(yǎng)基均大面積出現(xiàn)黑褐色現(xiàn)象，甚至發(fā)現(xiàn)有外植體枯死。可能是因?yàn)楸旧砹阌嘧觾?nèi)所含酚類物質(zhì)較多，再加上進(jìn)行接種前切成小塊材料，損傷面較大，損傷面細(xì)胞中的酚類物質(zhì)，與氧氣聚合發(fā)生氧化反應(yīng)，形成較多的有毒醌類物質(zhì)，擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，從而抑制其它酶的活性，毒害整個(gè)外植體組織[7,8]。
2.2不同外源物質(zhì)對(duì)褐化的抑制作用
根據(jù)試驗(yàn)觀察結(jié)果，加入3種外源物質(zhì)在早期均能有效抑制外植體的褐化，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，3種外源物質(zhì)抑制褐化作用開始分化，C處理（MS+0.1%活性炭）最早發(fā)現(xiàn)外植體褐化，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的再次延長(zhǎng)，褐化現(xiàn)象越來(lái)越重，外植體基部培養(yǎng)基褐化塊直徑最大達(dá)到4cm；MS+80mg/L半胱氨酸組合在褐化抑制作用上較好于C處理，此次試驗(yàn)表現(xiàn)出最佳抑制效果的是A組合，即：MS+150mg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，其在培養(yǎng)早期發(fā)現(xiàn)只有2個(gè)樣本有輕微褐化現(xiàn)象，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的逐步增加，褐化程度表現(xiàn)也并不十分明顯，僅僅在培養(yǎng)35d左右時(shí)，在外植體基部培養(yǎng)基出現(xiàn)了少量的褐化現(xiàn)象，而且褐化塊的直徑僅為0.8cm左右，各處理褐化抑制作用趨勢(shì)見圖1所示，組合B與組合C的發(fā)生褐化平均瓶數(shù)在同一培養(yǎng)時(shí)間段均高于組合A，同時(shí)組合A在培養(yǎng)20d至40d時(shí)間段出現(xiàn)褐化樣本數(shù)增幅不大，所以圖1組合A的抑制作用趨勢(shì)圖也較組合B與組合C平穩(wěn)，因此組合A對(duì)樣本褐化的抑制起到了較好的作用。
2.3不同培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)外植體褐化的影響
外植體褐化現(xiàn)象在固體基質(zhì)培養(yǎng)與液體基質(zhì)培養(yǎng)兩種方式表現(xiàn)差別十分明顯，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，外植體的褐化程度在加了0.7%瓊脂的固體培養(yǎng)基中表現(xiàn)明顯大于液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到15d左右時(shí)，外植體基部的固體培養(yǎng)基均出現(xiàn)較明顯的褐化現(xiàn)象，以外植體基部為中心，培養(yǎng)基褐化平均直徑為1.5cm；培養(yǎng)時(shí)間逐步延長(zhǎng)至30d，組培苗基部培養(yǎng)基褐化直徑達(dá)到了4cm左右，部分組培苗出現(xiàn)輕度枯化現(xiàn)象。液體
培養(yǎng)方式在培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到30d時(shí)，未發(fā)現(xiàn)組培苗有明顯的褐化現(xiàn)象，外植體生長(zhǎng)狀況良好，但培養(yǎng)時(shí)間達(dá)40d后，有少量外植體出現(xiàn)枯化現(xiàn)象，原因可能是因酚類物質(zhì)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的有毒醌類物質(zhì)在液體中容易被稀釋，在短時(shí)間內(nèi)無(wú)法在液體培養(yǎng)基中形成一個(gè)有效作用濃度點(diǎn)，所以外植體生長(zhǎng)狀況在一定時(shí)間內(nèi)正常。外植體褐化率與培養(yǎng)時(shí)間在固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)之間的區(qū)別如圖2所示，液體培養(yǎng)的外植體褐化率在30d后僅為3%左右，而固體培養(yǎng)褐化率在此時(shí)間段達(dá)到了50%，兩種處理在圖2表現(xiàn)出的走勢(shì)有顯著區(qū)別，液體培養(yǎng)方式比固體培養(yǎng)方式更適宜山組培苗的快繁。
3討論
褐化是指植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，由于外植體組織被切割和接種快繁時(shí)，損傷切面細(xì)胞中酚類物質(zhì)（底物）在酚氧化酶的作用下與氧氣聚合而發(fā)生氧化反應(yīng)，形成有毒的醌類物質(zhì)，外植體切面迅速變成棕褐色或暗褐色，并逐步擴(kuò)散至培養(yǎng)基中，抑制其它酶的活性，導(dǎo)致組織代謝紊亂，生長(zhǎng)受抑制，最終致使外植體死亡[5,9,10]。組織培養(yǎng)中抑制褐變方法目前已有大量的研究，如選擇適宜的外植體、培養(yǎng)溫度、PH值，培養(yǎng)時(shí)對(duì)外植體進(jìn)行多次轉(zhuǎn)移，在培養(yǎng)基中添加防褐劑（抗氧化劑），如抗壞血酸(Vc)、亞硫酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等[4,6,11]。但在山組織培養(yǎng)中還鮮見相關(guān)抑制外植體褐化報(bào)道。研究表明，山藥組織培養(yǎng)中不同外植體褐化程度也不同，山藥植株后期結(jié)出的零余子褐化程度最嚴(yán)重，而其幼嫩節(jié)間部褐化程度最輕。在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑均在一定時(shí)間內(nèi)能有效抑制外植體的褐化，但山藥外植體愈傷組織分化的時(shí)間大約為25d左右[2]，所以，只有MS+150mg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)為最適宜配方。因山藥組培苗快繁周期大約30d左右[2]，而液體基質(zhì)培養(yǎng)方式正好在這一段時(shí)間內(nèi)能使有毒醌類物質(zhì)無(wú)法形成一個(gè)有效作用濃度點(diǎn)，因此，在山藥組培苗的快繁階段采用未加瓊脂的液體培養(yǎng)基能有效其褐化，提高成活率。褐化是植物組織培養(yǎng)中較為普遍的現(xiàn)象，要從根本上解決這種褐化問(wèn)題，需對(duì)褐化發(fā)生的原因、生理生化、遺傳因素及植物品種等方面進(jìn)行更深入的研究。
參考文獻(xiàn)
[1]顏昌敬.植物組織培養(yǎng)手冊(cè)[M].上海:上�？茖W(xué)技術(shù)出版社,1990.
[2]蔡建榮,曾軍,等.懷山藥莖段組織培養(yǎng)及增殖的研究[J].福建科技,2002,(2):14-15.
[3]Mager AM,Harel.Polyphenol Oxidases in plants[J].Phytochemistry,1979,18:193-215.
[4]劉用生.植物組織培養(yǎng)中活性炭的使用.植物生通訊,1994,30(3):214.
[5]魯旭東.植物組織培養(yǎng)中褐變的發(fā)生與防止[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),1999,19(4):9.
[6]王東霞,等.如何對(duì)抗植物組織中的組織褐變.中國(guó)花卉盆景,2002,12:29-30.
[7]Alfred M Mayer.Polyphenol oxidase in plants--resent progress[J].Phytochemistry,1987,26:11-20.
[8]謝春艷,等.多酚氧化酶及其生理功能.生物學(xué)通報(bào),1999,34(6):11-13.
[9]丁連忠.抗壞血酸衍生物抑制蘑菇的多酚氧化酶.食品科學(xué),1991,67(2):22-25.
[10]于清章,史國(guó)榮,等.幾種防褐變劑對(duì)去皮切片馬鈴薯儲(chǔ)藏的影響[J].長(zhǎng)江蔬菜,1998,(11):25-26.
[11]Mohsen K.H.Influence of medium solidification and PH value on invitro propagation of marauta.leuconeura CV[J].Kerchoviana ScienceHorticulture,2000,(86):211-221.
【山藥組織培養(yǎng)褐化反應(yīng)的研究】相關(guān)文章：
中藥甘草的不良反應(yīng)和對(duì)策研究03-01
淺談松褐天牛的危害及防治03-17
庭審規(guī)范化問(wèn)題研究03-18
教育電子商務(wù)化研究03-21
關(guān)于IT渠道扁平化的研究03-19
研究民生新聞娛樂(lè)化的熱潮03-27