骨缺損使用異種骨治療的瓶頸及展望
骨移植是臨床醫(yī)生治療骨不連、骨缺損以及進行關節(jié)融合的重要手段，以下是小編搜集整理的一篇探究骨缺損使用異種骨治療問題的論文范文，供大家閱讀參考。
自體骨由于具有骨傳導性、骨誘導性、成骨性等優(yōu)點是骨移植材料的金標準，但由于其增加患者創(chuàng)傷、加重患者痛苦等促使臨床醫(yī)生尋求替代材料。異種骨作為20世紀50~60年代興起的骨移植材料，具有來源廣泛、價格低廉等優(yōu)點且理化特性與人骨質類似，具有廣闊的發(fā)展前景。目前困擾骨科醫(yī)生的主要問題為怎樣使異種骨由死骨變活骨，從而使其表現(xiàn)出類似自體骨生物力學性能。本文就異種骨免疫學特性、異種骨材料制備及異種骨活化進行深入討論。
1異種骨免疫學特性
異種組織免疫原特性與人體組織免疫原特性差異很大，因此充分掌握異種骨組織免疫學特點是進行異種骨材料研究的必要前提。骨組織中無機成分主要是碳酸羥基磷灰石，與人骨類似，因此異種骨去除有機成分后無免疫原性且生物相容性較好。有機成分主要為膠原蛋白，其中95%為Ⅰ型膠原，一般認為在種系間結構組成差異不大，其抗原部分主要為氨基末端區(qū)域，該抗原成分不引發(fā)明顯免疫反應，也不影響成骨作用。引發(fā)免疫反應的主要成分包括骨細胞、成骨細胞、破骨細胞等，所有這些細胞表面均存在MHC-Ⅰ型抗原及α-Gal抗原;MHC-Ⅱ抗原主要存在于骨髓細胞表面。在異種移植由于種屬間MHC結構差異較大，T細胞借助于受者的抗原遞呈細胞，通過間接途徑識別抗原引發(fā)免疫反應。α-Gal抗原是主要存在于靈長目以外哺乳動物體內的異種抗原，該抗原主要通過與人血清內存在的抗α-Gal抗體結合而引發(fā)體液免疫反應[1].盡管目前存在多種去抗原處理方法，但其核心均為破壞上述細胞結構完整性，去除抗原蛋白組分。輕微免疫學反應對其生物性能無不良影響，而過分追求消除免疫反應反而可降低成骨性能，故今后研究方向應從單純物種間免疫反應差異向免疫反應與生物活性方面轉變。
2異種骨材料制備
由于種屬間免疫學差異導致其與人體組織相容性差，直接用于人體引起強烈的免疫排斥反應，因此去除抗原物質是保證異種骨載體良好性能的前提。
經(jīng)過去抗原處理的異種骨應具備以下特點：良好的組織相容性，并隨本體骨組織的長入降解為可吸收組分;具有多孔結構，有利于營養(yǎng)物質輸送、組織細胞的粘附增殖等;具有骨傳導性。為達到上述目的，研究人員設計出多種去抗原處理方法，依據(jù)處理媒介不同主要分為物理方法和化學方法。
2.1物理方法
目前常用的物理異種骨脫抗原方法包括高溫煅燒和冷凍凍干骨。高溫煅燒主要通過碳化作用破壞骨內有機質從而徹底消除其抗原性，煅燒后其主要成分為羥基磷灰石。對異種骨進行高溫處理時，其成分變化主要經(jīng)歷以下階段：低于200℃時主要是水分的喪失;200~300℃開始破壞細胞成分;高于300℃時膠原及蛋白組分開始燃火;400~900℃時碳酸磷灰石逐步轉變?yōu)榱u磷灰石，從而引發(fā)骨材料結晶度等方面的'改變。在300℃煅燒骨組織時不改變結晶度及無機組分，在材料表面形態(tài)及理性特性等方面與人骨類似。有證據(jù)表明在300℃煅燒的BioOss骨材料內殘留Ⅰ型膠原及表面氮，這些物質可能有利于改善其力學特性及生物相容性。Rokn等[2]發(fā)現(xiàn)Bio-Oss骨的成骨能力與β-磷酸三鈣相似，但其誘發(fā)的局部組織炎癥反應甚至更低且成骨性能更佳。與上述亞高溫處理相比，900℃以上處理異種骨時，獲得骨材料不含有機組分因此不需擔心免疫反應的影響，組織成分主要為HA(羥磷灰石)。Pra-manik等[3]研究發(fā)現(xiàn)牛骨在900℃進行煅燒時可獲得納米羥基磷灰石，該晶體材料具有相互交通密集孔從而提升其生物相容性，且物理性能較佳。但是此種方法獲得骨材料只具備骨傳導性，無骨誘導性，且其置入體內后能否逐步降解尚需進一步研究。
冷凍骨的一般處理溫度為-20℃，在冰結晶顆粒緩慢形成的過程中通過力學作用、化學損傷及酶反應而降低骨組織抗原性。該處理方法保留了骨組織中Ⅰ型膠原及BMP等成骨活性成分，與煅燒相比具有物理特性更佳且置入體內后誘導成骨作用更強等優(yōu)點。但是其祛除抗原作用較差，甚至引發(fā)免疫反應而影響成骨作用。Andrade等[4]發(fā)現(xiàn)-70℃對細胞等抗原成分破壞較-20℃效果更好，但同時對膠原蛋白造成損傷程度加重，損害骨組織機械特性。與之相比，深低溫冷凍后再對異種骨進行脫水處理其祛除抗原作用較為徹底。冷凍后的干燥脫水過程在降低免疫原性的起重要作用，其原理在于脫水過程所伴發(fā)的細胞內鈉離子濃度的增加。凍干骨殘留水分為3%~5%,保存時間可達4~5年。凍干異種骨具有生物力學特性較佳、經(jīng)濟方便等優(yōu)點。劉玉增等[5]以兔橈骨缺損作為實驗模型，對凍干異種凍干與凍干同種骨治療骨缺損效果進行對比分析，結果發(fā)現(xiàn)術后12周兩組組織學分析無明顯差異，置入異種骨大部為骨小梁替代，部分動物出現(xiàn)部分骨髓組織、髓腔再通。Long等[6]
對凍干骨進行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)尚有少了細胞組分殘留，T細胞增殖試驗亦證實其引發(fā)的免疫反應較其他處理方式更加強烈。盡管凍干骨物理特性較佳且有骨誘導特性但殘留抗原物質較多，因此最好與其他處理方式聯(lián)合應用，從而在保持其良好理化特性的同時最大限度的去除免疫原性。
2.2化學方法
該法主要利用化學試劑對異種骨進行脫脂、脫蛋白、脫細胞以及去除礦物質等處理獲得部分脫蛋白骨、完全脫脂脫蛋白骨及脫細胞骨基質等。傳統(tǒng)脫脂方法主要為氯仿、甲醇等有機溶劑浸泡，但其脫脂作用不完全且容易殘留從而危害人體健康。超臨界CO2作為一種較為成熟工業(yè)萃取劑最先應用于生物工程領域，該物質具有類似氣體的擴散性及液體的溶解能力，同時兼具低黏度，低表面張力的特性，使得超臨界流體能夠迅速滲透進入微孔隙的物質。田家亮等[7]利用超臨界CO2對豬骨進行脫脂處理，發(fā)現(xiàn)脫脂效果優(yōu)于傳統(tǒng)脫脂方法，且保存了骨組織微多孔結構和合適的孔隙率。但是超臨界CO2對設備要求高，增加工藝成本，尚難大規(guī)模應用于工業(yè)生產(chǎn)。
異種骨脫蛋白媒介包括次氯酸鈉、雙氧水、乙醇等，其中H2O2應用最多，其作用機制為通過強氧化作用使蛋白質變性，消除或減弱抗原性。高濃度H2O2浸泡可部分消除異種骨的抗原性，且浸泡時間越長抗原性消除越徹底，但浸泡時間增加以及H2O2濃度越高必然會損害骨組織機械強度，合適的處理時間目前較大爭議。高中禮等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)異種骨經(jīng)30%H2O2處理8h為最佳處理時間可使抗原性降至最低，最大程度地保留生物力學強度。但同時利用30%H2O2對骨組織進行脫蛋白處理，發(fā)現(xiàn)12~36h后有機物含量無明顯改變且細胞等抗原成分已基本祛除，超過30h對膠原蛋白及羥基磷灰石破壞加重，推薦處理時間在12~30h內為宜[9].
通過把上述化學處理劑綜合利用，研究人員探索出了BioCleanse骨組織處理系統(tǒng)：將骨組織沖洗后依次浸乙醇、雙氧水、洗滌劑及清洗液，同時在正負壓交替的環(huán)境下進行組織震蕩漂洗[10].該技術首先用于處理同種異體骨，可有效祛除骨中脂肪組織、細胞成分及其他抗原成分，在祛除抗原成分的同時可較好的保持理化特性且具有消毒滅菌效果。Katz等[11]以BioCleanse處理的牛骨作為實驗組，以同種異體羊骨作為對照組，置入羊脛骨缺損模型，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)BioCleanse處理異種骨所引發(fā)的免疫反應與同種異體骨相似，且與受體骨組織融合較佳，周圍組織無明顯纖維化反應。目前此類異種骨研究相對較少，其實際臨床效果有待進一步研究。
3重組異種骨
異種骨在經(jīng)上述脫抗原處理時，成骨作用相關的活性成分亦遭到破壞，所制備的異種骨支架近具備骨傳導性能或微弱的骨誘導性能，無成骨性能。單純異種骨材料置入體內后依靠兩端骨組織爬行替代，因此需要修復骨缺損作用緩慢甚至不能修復。而異種骨支架與成骨活性物質或細胞結合后可獲得成骨性能，臨床效果得到一定提升。
3.1異種骨與細胞重組
重組細胞來源包括胚胎干細胞、骨髓間充質干細胞以及脂肪間充質干細胞等。理論上胚胎干細胞性能最佳，但社會倫理問題等使其應用受限。骨髓間充質干細胞相關研究最為充分，其多能干細胞具有分離培養(yǎng)簡單、體外擴增迅速及有向成骨細胞分化趨勢等優(yōu)點，動物及臨床實驗均證明其與骨支架材料復合后成骨性能極佳[12].但以下問題限制其在臨床的廣泛應用：數(shù)量較少，約100000個骨髓細胞中含有1個骨髓間充質干細胞;隨體外擴增系數(shù)增加成骨性能下降;提取骨髓細胞時對身體局部傷害較大。作為骨髓間充質干細胞的潛在替代細胞，脂肪間充質干細胞相關研究近來逐漸增多。該細胞在細胞表面標志物、基因表達序列及分化潛能方面等與骨髓間充質干細胞相似，因此該細胞可發(fā)揮成骨作用。
Arrigoni等[13]以羥磷灰石做為支架材料與脂肪間充質干細胞復合用于修復兔脛骨骨缺損，結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比脂肪間充質干細胞可明顯改善骨組織產(chǎn)生速度。但骨間充質干細胞及脂肪間充質干細胞與支架材料復合后何者成骨性能更強目前仍未達成一致。Han等[14]以兔顱骨缺損為實驗模型對兩者成骨性能進行對比，發(fā)現(xiàn)兩者成骨性能相當。Niemeyer等[15]以羊脛骨缺損作為實驗模型對兩者進行對比，得出了骨髓間充質細胞成骨性能高于脂肪間充質細胞的結論。
3.2異種骨與骨形態(tài)蛋白重組
骨形態(tài)蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)是由兩相同條肽鏈構成的二聚體，包含多個功能各異的亞型。其中BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BMP9具有成骨潛能，其成骨作用關鍵在于誘導間質干細胞向前成骨細胞分化，BMP是惟一能夠使未分化骨細胞分化為成骨細胞和成軟骨細胞的細胞因子。
Long等[16]將牛松質骨與牛骨形態(tài)蛋白組成重組異種骨，對其分析發(fā)現(xiàn)其具有良好的生物力學性能和骨誘導性能，且無明顯免疫學反應。但BMP在骨組織中含量極低、提純過程費時費力，目前應用基因重組技術進行人工合成的rhBMP2和rhBMP7已進行商業(yè)化應用。Francis等[17]分析55例牙槽骨缺損修補手術中應用BMP重組異種骨與自體髂骨移植的資料，結果顯示BMP重組異種骨在臨床效果、影像學表現(xiàn)及術后感染發(fā)生率方面均優(yōu)于自體髂骨，且由于縮短手術時間未增加總體花費。
3.3異種骨與PRP重組
血小板可分泌多種促進骨生成細胞因子，如轉化生長因子的兩個亞分類TGFβ1和TGFβ2、血管內皮生長因子以及上皮生長因子等。將新鮮全血經(jīng)分離濃縮后獲得富血小板血漿(plateletrichplasma,PRP)，其血小板濃度可達全血幾倍至十幾倍，PRP與骨支架材料復合理論上可以促進骨質生成。PRP來自自身血液不僅容易獲得制作簡便價格低廉而且?guī)缀鯖]有安全隱患，并且其中的生長因子等生物活性因子的比例最接近人體，生長因子之間協(xié)同作用最佳[18].但其確切效果尚未取得一致意見。Park等[19]
以兔顱骨缺損為實驗模型，將PRP與支架材料植入骨缺損處，結果發(fā)現(xiàn)與單純植入支架材料的對照組相比，實驗組骨再生明顯增加。但Yoon等[20]同樣以兔顱骨缺損為實驗模型，以Bio-Oss復合PRP,結果發(fā)現(xiàn)其促進骨生成作用不明顯。S觃nchez等[21]
認為PRP(富血小板血漿)只在一個較小的濃度范圍內具有促進骨質生成作用，即其濃度在1000000/μl效果較佳，低于此濃度時其促進骨生成作用不甚明顯，而濃度過高時骨生成有抑制作用。
4異種骨血管化
血供是組織獲得氧氣與營養(yǎng)的必須條件，依靠分子擴散對骨營養(yǎng)的供應深度在100~200μm,異種骨材料置入體內后血管化是其與周圍骨組織融合的起始及關鍵環(huán)節(jié)。如僅依靠周圍血管自然長入，對于單純異種骨置入材料來說無疑會延長其融合時間，對于重組異種骨來說則會使其臨床效果大大折扣。因此，應采取有力措施促進異種骨血管化進程。
4.1原位異種骨血管化
原位異種骨血管化是指將VEGF、PDGF及EGF等生長因子與異種骨材料復合后置入體內，從而促進異種骨血管化進程。目前主要有2種方法：將生長因子與異種骨顆粒復合植入體內，此時生長因子釋放及講解均較快速，起效作用時間短暫;生長因子包埋如膠囊內可達到長期緩慢釋放的目的。Yoon等[20]利用富血小板纖維蛋白促進了局部血管結構的快速生長。與未復合富血小板纖維蛋白的移植物相比，加入富血小板纖維蛋白后血管化速度及新生骨的生產(chǎn)速度均明顯增加。此外，干細胞復合異種骨材料后同樣可以促進血管化。殷劍等[22]
將兔自體脂肪干細胞直接置于植骨周圍，與對照組相比，CT掃描發(fā)現(xiàn)實驗組血供及代謝未見明顯改善。該技術與其他血管化技術相比具有操作技術相對簡單、可行度高及不對機體造成損傷等優(yōu)點，但其血管化由外向內，進程相對緩慢。
4.2異位骨血管化
異位血管化將異種骨材料預先植入體內血供豐富的部位如皮下或肌肉內，使得局部血管從異種骨骨組織表面長入。楊佩等[23]
將脂肪干細胞與支架材料復合后置入鼠股四頭肌肌袋內，術后2、4周進行組織學檢測織發(fā)現(xiàn)支架孔隙中均長入大量血管，并有小動脈長入。但此時血管的生成部位等完全隨機進行不受人為控制，置入骨缺損部位時血管吻合較為困難。另一種方法是將局部組織內血管等包埋入異種骨組織內，可選擇動脈、靜脈或動靜脈回路作為其血供來源。待血管長入異種骨組織后，將此骨與血管一起移植到骨缺損部位。Matsuda等[24]利用脂肪干細胞與支架材料構成組織工程骨，通過中空管道包埋小鼠股動靜脈環(huán)路，結果在數(shù)周后發(fā)現(xiàn)血管網(wǎng)長入支架內。盡管該法血管化作用較為理想，但是不可避免的對局部血供造成破壞，可能引發(fā)缺血、血栓等不良后果。
4.3體外預血管化
體外預血管化是利用血管內皮細胞與異種骨材料體外混合培養(yǎng)，血管內皮細胞在體外培養(yǎng)后生成新血管。此外血管內皮細胞可促進骨先質細胞向成骨細胞分化，因此對局部骨組織生產(chǎn)亦有一定促進作用。Rouwkema等[25]首次利用骨原細胞和內皮細胞在骨架材料上培養(yǎng)出血管結構該體系的優(yōu)點在于骨原細胞可分泌較大量的VEGF,從而促進血管內皮細胞增殖分化;而內皮細胞通過分泌IGF-1、BMP-2等骨生成因子促進骨原細胞的生長分化。此外共培養(yǎng)體系內還需加入平滑肌細胞和周皮細胞，只有上述3種細胞復合在一起方能生產(chǎn)有功能的血管結構。經(jīng)過預血管化后植入體內的骨支架材料的血管化速度明顯增加。除血管內皮細胞外，具有多向分化潛能的間充質干細胞亦可分化為血管內皮細胞。
Koob等[26]將間皮干細胞以及內皮細胞與骨支架材料在體外共培養(yǎng)后置入鼠顱骨缺損模型，發(fā)現(xiàn)間皮干細胞具有穩(wěn)定內皮細胞形成初始血管結構的作用。體外構造血管網(wǎng)是一種非常理想的骨組織工程方法，該方法前景廣闊但難度大，目前尚處于實驗探究階段。
5展望
異種骨材料經(jīng)脫抗原，與細胞因子重組進一步血管化后可在體內發(fā)揮優(yōu)異的效果。目前異種骨材料的脫抗原制備已取得了良好成績，短時期內很難取得更大提升;而將異種骨材料重組及置入體內后血管化方興未艾，是當前研究的突破熱點。綜合利用各種細胞因子賦予異種骨材料骨誘導性的同時使其快速再血管化是當前研究未曾克服的難點，同樣這也是未來異種骨材料的發(fā)展方向。未來研究重點應為異種骨支架與多種細胞因子及細胞成分進行重組，并協(xié)調其相互作用以及與機體局部微環(huán)境的相互作用，使得骨組織再生與血管化協(xié)調進行，最終達到類似自體骨移植修復骨缺損的臨床效果。
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