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簡便有效分離培養大鼠主動脈內皮細胞的一種新方法
畢業論文作者：肖瓊 房云�！⌒焯N 田鏵 張立平 田興松
【摘要】 目的：探索分離、培養鼠主動脈內皮細胞的有效方法。方法：將鼠主動脈內膜翻向外，結扎兩端，置于50 mL培養瓶中培養、傳代，Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學染色。結果：培養6～8 d 時有少量細胞自主動脈遷移出并貼壁生長；12～14 d 時貼壁細胞覆蓋大部分培養瓶面，約80%的細胞匯合成單層；傳代細胞生長旺盛；細胞匯合后呈現典型的“鵝卵石”樣內皮細胞特征，內皮細胞標志物Ⅷ因子相關抗原表達陽性；未見雜細胞。結論：此方法無損傷、不需要酶消化，能比較容易的獲得高純度大鼠原代主動脈內皮細胞，適用于細小血管內皮細胞的分離與培養。
【關鍵詞】 主動脈·體外培養·內皮細胞·大鼠
A new method for isolation and culture of the endothelial cells of the rat aorta
【ABSTRACT】Objective:To investigate a modified method of isolating and culturing the endothelial cells from the rat aorta for endothelial bioresearch. Methods:Turned inside out, the aorta of the rat, of which the intima tunica was exposed, was ligated at both ends and cultured in a 50 mL culture bottle. Results:A small amount of cells migrated out from the aorta 6 to 8 days after cultured; the migrating cells spread over most of the culture surface of the bottle 12 to 14 days after cultured, 80% of them in a confluent monolayer. The confluent cells were identified as endothelial cells with the typical cobblestone appearance and the positive reaction for factor Ⅷ relative antigen, no other types of cells was observed. Conclusion:This is a woundless, nonenzymatic method of obtaining highly purified primary endothelial cells of the rat aorta, especially practical for isolation and culture of small vascular endothelial cells.
內皮細胞是研究心血管、炎癥、腫瘤等疾病最常用的工具。目前，對臍靜脈等較大血管原代內皮細胞的分離與培養1般采用酶消化法，技術已經成熟。但對于大鼠等小動物血管而言，由于管徑細小，操作難度大，其內皮細胞的分離與培養1直存在產量少、易混入雜細胞等問題 ［1］。本研究經過反復實驗，建立了1種有效獲取高純度、高數量大鼠原代血管內皮細胞的分離與培養方法。
1 材料與方法
1.1 實驗材料 4周齡Wistar 大鼠10只，均為雌性，體質量140～160 g（購自山東大學動物實驗中心），縫衣針，手術縫合線，胎牛血清（HyClone，購自美國），DMEM/F12培養基（Gibco，購自美國）。
1.2 培養方法
1.2.1 大鼠主動脈的原代培養 取Wistar 大鼠1只，無菌條件下打開腹腔和胸腔。截取主動脈約3 cm,放入含有青霉素105 U/L、鏈霉素100 mg/L的D-Hanks液中，用吸管將動脈管腔殘留的血液沖洗干凈�？p衣針去尖,牽引手術縫合線穿過主動脈管腔，縫合線的遠端就近結扎動脈的1端，血管鉗牽引縫合線近端，同時用鑷子輕輕反向下滑動脈，使主動脈內膜翻出，折入縫扎動脈的另1端，此時翻過來的動脈兩端被完全折入封閉。將動脈置于50 mL培養瓶中，加入含有20%胎牛血清的培養液，液體僅遮蓋主動脈即可，置于37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱中培養，3 d 換液1次。
1.2.２ 細胞傳代培養 原代培養約12 ～14 d，遷出生長的細胞覆蓋培養瓶面積的2/3以上，約80 %的細胞匯合即可傳代。取出主動脈，用D-Hanks液沖洗培養瓶2次，常規消化、吹打，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養液適量，制成細胞懸液，依照細胞的量按1：1或1：2傳代培養，3 d換液1次。另9只大鼠以同樣步驟重復上述實驗。
1.3 免疫細胞化學鑒定 在24孔培養板內放置無菌蓋玻片，每孔種植1 mL 含有104個細胞的懸液，待細胞生長至接近匯合時,取出蓋玻片，室溫下4%的多聚甲醛固定10 min,常規SABC法顯示血管內皮細胞標志物Ⅷ因子相關抗原（vWF）。
1.4 細胞純度分析 取6次培養的第2代主動脈內皮細胞，vWF免疫細胞化學染色后，每張蓋玻片400倍鏡下隨機選5個視野計數細胞，計算細胞陽性表達率（細胞陽性表達率=陽性細胞數/細胞總數）。
2 結果
2.1 形態學 原代培養6～8 d，在動脈附近可見少量的細胞遷出并貼壁生長，細胞呈短梭形或多角形。培養至12 ～14 d，遷移出生長的細胞覆蓋培養瓶面積的2/3以上，密度不勻，其中約80 %的細胞匯合成單層，呈現內皮細胞典型的“鵝卵石”樣特征（圖1）。傳代培養的細胞0.5 h開始貼壁，2 h后約90 %的細胞貼壁，4 ～5 d時細胞匯合成單層。培養至9代時，細胞質內有空泡出現，同時出現胞體瘦小，細胞呈現老化狀態。
2.2 免疫細胞化學染色 vWF免疫細胞化學染色，細胞質呈現棕黃色陽性反應。每張蓋玻片100倍鏡下隨機選10個視野進行觀察，均未見染色陰性表達細胞（圖2）。
2.3 細胞純度分析 vWF免疫細胞化學染色后，每張蓋玻片400倍鏡下隨機選5個視野計數細胞，所見細胞均為陽性染色細胞，陽性表達率為100%，即獲取的內皮細胞純度為100%。
重復實驗10次，均獲得同樣結果。
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3 討論
血管內皮細胞的原代分離與培養是研究其分子生物學特性及相關疾病的重要前提，大鼠是最常用的實驗動物之1。長期以來，由于大鼠血管細小，操作難度大，其血管內皮細胞的分離與培養尚缺乏理想的手段。鼠主動脈內皮細胞多采用酶消化法［2-3］和植塊法［4－6］。
酶消化法可以在相對短的時間內獲取細胞。大鼠主動脈較細，本實驗發現150 g的大鼠主動脈管徑約2 mm，其分支非常細且不易結扎，灌注的酶消化液容易經其分支滲漏至管外，使外膜也被消化，導致其他細胞混入；細胞產量亦較低，且大多需同時獲取多條動脈，操作復雜；有時因酶的活性改變而使消化時間難以掌控,不僅影響內皮細胞的分離和提取，亦可直接影響內皮細胞的活力［7］。
組織塊移植培養法操作簡單，對細胞活力無損傷，缺點為長出的細胞成分比較復雜，內皮細胞純度低［8］，常伴有成纖維細胞污染。由于成纖維細胞生長迅速，最終過度生長甚至覆蓋內皮細胞而影響內皮細胞增殖。有學者將大鼠主動脈外膜做瞬間熱處理后再進行植塊培養，提高獲取內皮細胞的純度至67.8%［6］。
本研究采取將大鼠主動脈內膜翻向外、兩端內折結扎后直接培養的方法獲取血管內皮細胞。結果發現，血管內皮細胞呈現接觸性抑制的“鵝卵石”樣特征，其標志物vWF表達陽性，未發現雜細胞等，提示獲得了數量可觀的單1的血管內皮細胞。本研究采用10只大鼠重復實驗，均獲得了同樣的結果，證明該方法具有可重復性。此方法的優勢在于：1）獲取的血管內皮細胞純度高、數量多。由于血管兩端內折結扎，整段血管僅內膜接觸培養瓶，外膜面的細胞不易遷出，經免疫細胞化學染色未發現vWF陰性細胞，有效避免了血管壁其他細胞的混入。1只大鼠的主動脈即可產出5×105個原代內皮細胞，細胞產出量相對較高，經傳代培養，可以滿足基本實驗需要。2）對細胞無損傷。內皮細胞是1種比較嬌嫩的細胞。本實驗方法無需酶消化，避免了酶消化過程中對細胞的破壞作用，同時節省了酶灌注和消化時間，操作時間短，有效保護了內皮細胞的活力。3）降低實驗費用。胰酶廉價、活性強，但對細胞的損傷大，因此多選用對細胞損傷少的膠原酶,但其價格昂貴。本實驗不需要酶消化，降低了實驗費用。4）操作過程簡便、快捷，減少了細胞被污染的幾率。
此方法解決了鼠主動脈內皮細胞難獲取的問題，也適用于其他較大動物細小血管內皮細胞的分離與培養，為進1步研究其內皮細胞的生物學特性及其相關疾病提供了良好平臺。
【參考文獻】
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［7］ 李淑香，王佐周，邱雪杉．酶消化對培養臍靜脈內皮細胞的影響[J]．解剖科學進展，2000，6（2）：186．
［8］ Nicosia RF, Villaschi S, Smith M. Isolation and characterization of vasoformative endothelial cells from the rat aorta[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1994, 30A（6）:394-399.
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