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簡(jiǎn)便有效分離培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的一種新方法
畢業(yè)論文作者：肖瓊 房云�！⌒焯N(yùn) 田鏵 張立平 田興松
【摘要】 目的：探索分離、培養(yǎng)鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的有效方法。方法：將鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜翻向外，結(jié)扎兩端，置于50 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)、傳代，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色。結(jié)果：培養(yǎng)6～8 d 時(shí)有少量細(xì)胞自主動(dòng)脈遷移出并貼壁生長(zhǎng)；12～14 d 時(shí)貼壁細(xì)胞覆蓋大部分培養(yǎng)瓶面，約80%的細(xì)胞匯合成單層；傳代細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛；細(xì)胞匯合后呈現(xiàn)典型的“鵝卵石”樣內(nèi)皮細(xì)胞特征，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá)陽(yáng)性；未見雜細(xì)胞。結(jié)論：此方法無損傷、不需要酶消化，能比較容易的獲得高純度大鼠原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，適用于細(xì)小血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。
【關(guān)鍵詞】 主動(dòng)脈·體外培養(yǎng)·內(nèi)皮細(xì)胞·大鼠
A new method for isolation and culture of the endothelial cells of the rat aorta
【ABSTRACT】Objective:To investigate a modified method of isolating and culturing the endothelial cells from the rat aorta for endothelial bioresearch. Methods:Turned inside out, the aorta of the rat, of which the intima tunica was exposed, was ligated at both ends and cultured in a 50 mL culture bottle. Results:A small amount of cells migrated out from the aorta 6 to 8 days after cultured; the migrating cells spread over most of the culture surface of the bottle 12 to 14 days after cultured, 80% of them in a confluent monolayer. The confluent cells were identified as endothelial cells with the typical cobblestone appearance and the positive reaction for factor Ⅷ relative antigen, no other types of cells was observed. Conclusion:This is a woundless, nonenzymatic method of obtaining highly purified primary endothelial cells of the rat aorta, especially practical for isolation and culture of small vascular endothelial cells.
內(nèi)皮細(xì)胞是研究心血管、炎癥、腫瘤等疾病最常用的工具。目前，對(duì)臍靜脈等較大血管原代內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)1般采用酶消化法，技術(shù)已經(jīng)成熟。但對(duì)于大鼠等小動(dòng)物血管而言，由于管徑細(xì)小，操作難度大，其內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)1直存在產(chǎn)量少、易混入雜細(xì)胞等問題 ［1］。本研究經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了1種有效獲取高純度、高數(shù)量大鼠原代血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 4周齡Wistar 大鼠10只，均為雌性，體質(zhì)量140～160 g（購(gòu)自山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），縫衣針，手術(shù)縫合線，胎牛血清（HyClone，購(gòu)自美國(guó)），DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco，購(gòu)自美國(guó)）。
1.2 培養(yǎng)方法
1.2.1 大鼠主動(dòng)脈的原代培養(yǎng) 取Wistar 大鼠1只，無菌條件下打開腹腔和胸腔。截取主動(dòng)脈約3 cm,放入含有青霉素105 U/L、鏈霉素100 mg/L的D-Hanks液中，用吸管將動(dòng)脈管腔殘留的血液沖洗干凈。縫衣針去尖,牽引手術(shù)縫合線穿過主動(dòng)脈管腔，縫合線的遠(yuǎn)端就近結(jié)扎動(dòng)脈的1端，血管鉗牽引縫合線近端，同時(shí)用鑷子輕輕反向下滑動(dòng)脈，使主動(dòng)脈內(nèi)膜翻出，折入縫扎動(dòng)脈的另1端，此時(shí)翻過來的動(dòng)脈兩端被完全折入封閉。將動(dòng)脈置于50 mL培養(yǎng)瓶中，加入含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液，液體僅遮蓋主動(dòng)脈即可，置于37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，3 d 換液1次。
1.2.２ 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)約12 ～14 d，遷出生長(zhǎng)的細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶面積的2/3以上，約80 %的細(xì)胞匯合即可傳代。取出主動(dòng)脈，用D-Hanks液沖洗培養(yǎng)瓶2次，常規(guī)消化、吹打，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液適量，制成細(xì)胞懸液，依照細(xì)胞的量按1：1或1：2傳代培養(yǎng)，3 d換液1次。另9只大鼠以同樣步驟重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。
1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 在24孔培養(yǎng)板內(nèi)放置無菌蓋玻片，每孔種植1 mL 含有104個(gè)細(xì)胞的懸液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至接近匯合時(shí),取出蓋玻片，室溫下4%的多聚甲醛固定10 min,常規(guī)SABC法顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Ⅷ因子相關(guān)抗原（vWF）。
1.4 細(xì)胞純度分析 取6次培養(yǎng)的第2代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，vWF免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，每張蓋玻片400倍鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率（細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）。
2 結(jié)果
2.1 形態(tài)學(xué) 原代培養(yǎng)6～8 d，在動(dòng)脈附近可見少量的細(xì)胞遷出并貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈短梭形或多角形。培養(yǎng)至12 ～14 d，遷移出生長(zhǎng)的細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶面積的2/3以上，密度不勻，其中約80 %的細(xì)胞匯合成單層，呈現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞典型的“鵝卵石”樣特征（圖1）。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞0.5 h開始貼壁，2 h后約90 %的細(xì)胞貼壁，4 ～5 d時(shí)細(xì)胞匯合成單層。培養(yǎng)至9代時(shí)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有空泡出現(xiàn)，同時(shí)出現(xiàn)胞體瘦小，細(xì)胞呈現(xiàn)老化狀態(tài)。
2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 vWF免疫細(xì)胞化學(xué)染色，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)。每張蓋玻片100倍鏡下隨機(jī)選10個(gè)視野進(jìn)行觀察，均未見染色陰性表達(dá)細(xì)胞（圖2）。
2.3 細(xì)胞純度分析 vWF免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，每張蓋玻片400倍鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，所見細(xì)胞均為陽(yáng)性染色細(xì)胞，陽(yáng)性表達(dá)率為100%，即獲取的內(nèi)皮細(xì)胞純度為100%。
重復(fù)實(shí)驗(yàn)10次，均獲得同樣結(jié)果。
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3 討論
血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代分離與培養(yǎng)是研究其分子生物學(xué)特性及相關(guān)疾病的重要前提，大鼠是最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之1。長(zhǎng)期以來，由于大鼠血管細(xì)小，操作難度大，其血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)尚缺乏理想的手段。鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞多采用酶消化法［2-3］和植塊法［4－6］。
酶消化法可以在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)獲取細(xì)胞。大鼠主動(dòng)脈較細(xì)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)150 g的大鼠主動(dòng)脈管徑約2 mm，其分支非常細(xì)且不易結(jié)扎，灌注的酶消化液容易經(jīng)其分支滲漏至管外，使外膜也被消化，導(dǎo)致其他細(xì)胞混入；細(xì)胞產(chǎn)量亦較低，且大多需同時(shí)獲取多條動(dòng)脈，操作復(fù)雜；有時(shí)因酶的活性改變而使消化時(shí)間難以掌控,不僅影響內(nèi)皮細(xì)胞的分離和提取，亦可直接影響內(nèi)皮細(xì)胞的活力［7］。
組織塊移植培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞活力無損傷，缺點(diǎn)為長(zhǎng)出的細(xì)胞成分比較復(fù)雜，內(nèi)皮細(xì)胞純度低［8］，常伴有成纖維細(xì)胞污染。由于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，最終過度生長(zhǎng)甚至覆蓋內(nèi)皮細(xì)胞而影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖。有學(xué)者將大鼠主動(dòng)脈外膜做瞬間熱處理后再進(jìn)行植塊培養(yǎng)，提高獲取內(nèi)皮細(xì)胞的純度至67.8%［6］。
本研究采取將大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜翻向外、兩端內(nèi)折結(jié)扎后直接培養(yǎng)的方法獲取血管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)接觸性抑制的“鵝卵石”樣特征，其標(biāo)志物vWF表達(dá)陽(yáng)性，未發(fā)現(xiàn)雜細(xì)胞等，提示獲得了數(shù)量可觀的單1的血管內(nèi)皮細(xì)胞。本研究采用10只大鼠重復(fù)實(shí)驗(yàn)，均獲得了同樣的結(jié)果，證明該方法具有可重復(fù)性。此方法的優(yōu)勢(shì)在于：1）獲取的血管內(nèi)皮細(xì)胞純度高、數(shù)量多。由于血管兩端內(nèi)折結(jié)扎，整段血管僅內(nèi)膜接觸培養(yǎng)瓶，外膜面的細(xì)胞不易遷出，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色未發(fā)現(xiàn)vWF陰性細(xì)胞，有效避免了血管壁其他細(xì)胞的混入。1只大鼠的主動(dòng)脈即可產(chǎn)出5×105個(gè)原代內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞產(chǎn)出量相對(duì)較高，經(jīng)傳代培養(yǎng)，可以滿足基本實(shí)驗(yàn)需要。2）對(duì)細(xì)胞無損傷。內(nèi)皮細(xì)胞是1種比較嬌嫩的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)方法無需酶消化，避免了酶消化過程中對(duì)細(xì)胞的破壞作用，同時(shí)節(jié)省了酶灌注和消化時(shí)間，操作時(shí)間短，有效保護(hù)了內(nèi)皮細(xì)胞的活力。3）降低實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。胰酶廉價(jià)、活性強(qiáng)，但對(duì)細(xì)胞的損傷大，因此多選用對(duì)細(xì)胞損傷少的膠原酶,但其價(jià)格昂貴。本實(shí)驗(yàn)不需要酶消化，降低了實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。4）操作過程簡(jiǎn)便、快捷，減少了細(xì)胞被污染的幾率。
此方法解決了鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞難獲取的問題，也適用于其他較大動(dòng)物細(xì)小血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，為進(jìn)1步研究其內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性及其相關(guān)疾病提供了良好平臺(tái)。
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