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高效液相色譜法測定苯扎貝特中的有關(guān)物質(zhì)
摘 要：目的：對采用高效液相色譜法測定苯扎貝特當(dāng)中的有關(guān)物質(zhì)進行研究。方法：USKH071233C18：甲醇=4：6，流動相是磷酸二氫鉀溶液，在檢測的過程中，檢測波長度為228nm，流速為1.0ml/min。結(jié)果苯扎貝特和五種主要的雜質(zhì)都能取得良好的分離效果。結(jié)論：這種測定方法在應(yīng)用的過程中能夠體現(xiàn)出非常高的靈敏度和準(zhǔn)確度，因此這種方法也可以應(yīng)用在苯扎貝特有關(guān)物質(zhì)含量的控制和測定當(dāng)中。
關(guān)鍵詞：苯扎貝特;系統(tǒng)適用性;有關(guān)物質(zhì)
苯扎貝特是一種氯貝丁酸衍生物類的血脂調(diào)節(jié)類藥物，在降血脂方面，其具備兩種機制：首先是提高脂蛋白脂酶和肝脂酶的活性，這樣也就使得低濃度的蛋白可以更加迅速的完成分解和代謝功能，從而使得上血甘油三脂的水平出現(xiàn)了非常明顯的下降現(xiàn)象，從而也就使得基底密度的脂蛋白分泌量出現(xiàn)非常顯著的減少現(xiàn)象，從而也就十分有效的降低了血低密度蛋白酶的量以及膽固醇的水平，在生產(chǎn)的過程中可能會出現(xiàn)一定的雜質(zhì)，所以我們需要對其進行測定和分離，保證藥物的藥效。
一、儀器與試藥
高效液相色譜儀系統(tǒng)：Agilent 1200檢測器： Agilent 1200分離單元(四元泵、自動進樣器、柱溫箱);軟件：安捷倫工作站;HP1020打印機。苯扎貝特EP標(biāo)準(zhǔn)品(lot：n0.1.a);甲醇(色譜純04020-3，OCEANPAK ALEXATIVE CHEMLCAL);雜質(zhì)A(lot：20061116，含量：99.8%中間體);雜質(zhì)B(lot：T20060919，含量：100%國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，雜質(zhì)C(lot：20061101，含量：99.6%自制)，雜質(zhì)D(lot：20061101，含量：99.5%自制)，雜質(zhì)E(lot：20070226，含量：99.5%自制)。
二、方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
色譜柱： USKH071233C18(5um)0.125m×4mm。流速為1ml/min;檢測波長為228nm。流動相：磷酸二氫鉀溶液(2.72g/L，用磷酸調(diào)節(jié)PH2.3)：甲醇=4：6;進樣量：20ul。
2.2 溶液制備
供試樣品溶液：精確稱取該品50mg，將其放置在容積為100ml的容量瓶當(dāng)中，加入一定的流動相，采用超聲波的方式使其溶解，將其靜置直至其溫度達到室溫的水平。用流動相稀釋到刻度的位置，將其混合均勻之后配制成0.5mg/ml的溶液。對照品溶液(a)精確量取供試品溶液10ml，加入流動相之后將其放入到容積為100ml的容量瓶當(dāng)中，稀釋到刻度的位置。再吸出5.0ml的上述溶液，加入適量的流動相，使其稀釋到100ml。對照品溶液(b)：精確吸取對照品溶液(a)5.0ml，加入適量的流動相將其稀釋到50.0ml即完成了對照品溶液(b)的配制。對照品溶液(c)：精確量取1ml的試驗溶液和1ml濃度為1mol/L的鹽酸溶液，和其充分的混合之后，在電熱板上進行加熱處理，直至蒸干。殘渣使用流動相進行溶解處理，同時壞要將其稀釋到20ml。
2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗
系統(tǒng)在運行的過程中達到相對平衡的狀態(tài)之后，根據(jù)上述的色譜條件精確量取對照溶液(a)20μl進行進樣處理，對系統(tǒng)的靈敏度進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，從而使得主峰的高度占到記錄儀最大刻度的5成以上，連續(xù)進樣5次，從而得到苯扎貝特峰計算的理論塔板數(shù)N=3916，峰面積RSD=1.0%，在2.0%以內(nèi)。之后再精確的量取對照溶液(c)20μl進行進樣處理，對這一過程中的色譜圖進行全面的記錄。在記錄對照液(c)的色譜圖過程中，兩個主峰分離度達到了5.0以上。在對對照液(b)的色譜圖進行記錄的過程中發(fā)現(xiàn)色譜圖當(dāng)中的信噪至少是5。
空白測試：取適量的流動相進行進樣處理，作為容積空白，這也充分的標(biāo)明流動相對雜質(zhì)的測定并不會產(chǎn)生負面的影響，樣品測定過程中的溶劑峰可以忽略不計。
2.4 方法的專屬性
2.4.1 結(jié)構(gòu)確認(委托中國藥科大學(xué)檢測)：經(jīng)紅外光譜，核磁共振，質(zhì)譜等結(jié)構(gòu)解析確證各雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
2.4.2 單個雜質(zhì)的定性。依次取“2.7線性關(guān)系項下雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)貯備液”(雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E和雜質(zhì)F)1.0mL，各至一個50mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，混合均勻。每個溶液分別進樣，記錄各組分的保留時間，用保留時間對每個雜質(zhì)進行定性。
2.5 破壞性試驗
精密稱取樣品細粉10mg，將其放入到容積為10ml的容量瓶當(dāng)中，將其平均分成5份，對其分別進行高溫、光照、強酸、強堿和強氧化等破壞性試驗，使用流動相將其稀釋成濃度為1mg/ml的溶液，分別對其進行進樣測定。測定之后發(fā)現(xiàn)所有破壞條件下降解產(chǎn)物和主成分峰分離的效果非常好。
2.6 精密度和重復(fù)性
在重復(fù)性和中間精密度測試項之下，標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進行6次進樣處理，各組分的峰面積RSD都在2.0%之內(nèi)，重復(fù)性和中間的密度并沒有非常明顯的差異。
2.7 線性關(guān)系考察
雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別嚴(yán)格按照要求去稱取以下標(biāo)準(zhǔn)品：分別精密稱取以下標(biāo)準(zhǔn)品：雜質(zhì)A～E和苯扎貝特10.0mg，各至一個25ml容量瓶中，各加入流動相溶解并稀釋至刻度，混合均勻，得到每個雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。每個雜質(zhì)的濃度均約為400ug/ml。雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(a)分別量取雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液5.0ml，將其放入到容積為100.0ml的容量瓶當(dāng)中，使用適量的流動相將其稀釋到刻度的位置，同時還要進行搖勻處理。各雜質(zhì)和苯扎貝特的濃度為20μg/ml。
雜質(zhì)線性標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別取雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(a)0.5ml，1.0ml，2.5ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，8.0ml各至一個50.0ml容量瓶，用流動相稀釋至刻度，混合均勻，得到No.1～No.7線性標(biāo)準(zhǔn)溶液。各雜質(zhì)及苯扎貝特的濃度范圍為0.2～3.2ug/ml，相當(dāng)于雜質(zhì)及苯扎貝特含量0.02%～0.32%。測定：分別取No.1～No.7線性標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進樣，每個濃度連續(xù)進3次，記錄色譜圖。以各組分峰面積平均值對其濃度(ug/ml)，使用origin5.0軟件進行線性回歸，得到各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在線性測試項下各組分峰面積與溶液的濃度均成線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)r均大于0.999，該方法的線性關(guān)系良好。
2.8 回收率
以中間精密度項下5號現(xiàn)象標(biāo)準(zhǔn)溶液為主要標(biāo)準(zhǔn)，按照其特定的公式來對回收率進行統(tǒng)計，同時還要計算出平均的回收率。在回收率測試項當(dāng)中，各個組分在不同濃度下不同雜質(zhì)的平均回收率都處在了85.0%-115.0%之間。
2.9 雜質(zhì)檢測限、定量限的測定
在色譜系統(tǒng)下進樣，記錄色譜圖。當(dāng)待測組分的信噪比為2～3倍時，對應(yīng)的濃度為該組分的最小檢測濃度(Cm1);當(dāng)待測組分的信噪比為10～20倍時，對應(yīng)的濃度為該組分的最小定量濃度(Cm2)。所有測定雜質(zhì)的檢測限結(jié)果范圍從0.001%～0.002%，定量限結(jié)果范圍從0.002%～0.02%;其它未知雜質(zhì)的檢測限和定量限以苯扎貝特進行評價，依次為0.001%和0.002%。
2.10 樣品的穩(wěn)定性
取0.5mg・mL-1樣品溶液分別于0、5、10、20、30和50h進樣測定。結(jié)果表明，樣品放置室溫下，2天穩(wěn)定性良好。
2.11 樣品有關(guān)物質(zhì)測定�？瞻诇y試：取流動相20μL進樣，記錄色譜圖。在樣品的測試中忽略溶劑峰。取樣品溶液20μL進樣，記錄色譜圖。樣品雜質(zhì)含量測定結(jié)果符合規(guī)定。
三、討論
在本實驗當(dāng)中，研究人員采用的是高效液相色譜法對相關(guān)物質(zhì)進行測定，這種方法能夠有效的對苯扎貝特的主成分，中間體和分離產(chǎn)物進行分離處理，這種方法操作便捷，同時還具備非常強的專屬性。這種方法在很廣泛的范圍之內(nèi)都能體現(xiàn)出較好的檢測靈敏度，同時還能對中間體和其他雜質(zhì)進行全面的檢查，具有非常強的優(yōu)越性。
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