復(fù)方牡蠣根管充填糊劑的皮膚致敏性觀察
作者：劉夢(mèng)冬 鄧婧 許曉燕 孫慧斌 尚偉【摘要】 目的 評(píng)價(jià)一種新型根管充填糊劑——復(fù)方牡蠣糊劑潛在的皮膚致敏性。方法 采用豚鼠最大劑量試驗(yàn)方法，選用健康白色豚鼠40只，隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、粉劑組、混合物組、陽(yáng)性對(duì)照組（各10只），分別于皮內(nèi)注射9 g/L氯化鈉溶液、材料粉劑浸提液、材料混合物浸提液、50 g/L 甲醛溶液與完全弗氏佐劑的乳化液，進(jìn)行初次致敏，1周后進(jìn)行二次致敏，于二次致敏后第14天進(jìn)行激發(fā)接觸，分別于24、48、72 h后觀察注射處皮膚有無(wú)紅斑、水腫現(xiàn)象，并計(jì)算致敏率。結(jié)果 陰性對(duì)照組、粉劑組與混合物組動(dòng)物均無(wú)明顯致敏反應(yīng)，陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)明顯紅斑、水腫現(xiàn)象。粉劑組致敏率10%，混合物組的致敏率為0。結(jié)論 復(fù)方牡蠣糊劑作為根管充填糊劑無(wú)潛在的皮膚致敏性。
【關(guān)鍵詞】 根管充填材料；皮膚致敏試驗(yàn)；殼聚糖；豚鼠
根管治療術(shù)的臨床療效與根管充填糊劑的性能有密切的關(guān)系。目前，國(guó)內(nèi)臨床上常用的根管充填糊劑各有優(yōu)缺點(diǎn)，傳統(tǒng)的根管充填材料（氧化鋅丁香油糊劑、根管充填糊劑）雖然價(jià)格低廉，但有不少弊端。國(guó)外產(chǎn)品（如紅糊，Vitapex）雖然性能優(yōu)越，但價(jià)格昂貴，難以在國(guó)內(nèi)普及。復(fù)方牡蠣糊劑是將傳統(tǒng)中藥牡蠣粉與羧甲基殼聚糖混合制成的一種糊劑，具有根管充填糊劑所應(yīng)有的多種特性，并可能修復(fù)根尖周組織。該材料作為根管填充材料應(yīng)用于臨床需要進(jìn)行系列的實(shí)驗(yàn)研究。本文根據(jù)ISO?10993?1標(biāo)準(zhǔn)[1]，對(duì)該材料的必測(cè)項(xiàng)目——皮膚致敏性進(jìn)行研究，以對(duì)其生物相容性進(jìn)行初步的檢測(cè)。
1 材料和方法
1.1 材料
牡蠣殼粉（生物碳酸鈣），產(chǎn)自渤海灣，細(xì)度200目，由中國(guó)海洋大學(xué)提供；羧甲基殼聚糖，由中國(guó)海洋大學(xué)提供；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（National Appounce）、完全弗氏佐劑（FCA，SIGMA?ALDRICH CO.），均產(chǎn)自美國(guó)。
健康白色豚鼠40只（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供），體質(zhì)量300～500 g，隨機(jī)分為4組，分別為粉劑組、混合物組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。
1.2 方法
1.2.1 材料制備 將牡蠣殼粉作為材料的粉劑，將500 mg 羧甲基殼聚糖加熱溶解于10 mL雙蒸水中(50 g/L），作為該材料的液劑。將牡蠣殼粉過(guò)200目篩孔后與羧甲基殼聚糖液按1.5∶1.0 (V/V)的比例混合調(diào)成糊狀，待其凝固作為該材料的混合物。根據(jù)我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886.5?1997的規(guī)定，將材料粉劑及調(diào)合固化24 h的混合物粉碎后，經(jīng)高溫、高壓消毒，按0.2 kg/L的比例溶于9 g/L氯化鈉溶液中，配成200 g/L的溶液，置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱24 h，取其上清液即為材料浸提液。取完全弗氏佐劑按照1∶1比例分別與材料浸提液及9 g/L氯化鈉溶液和50 g/L 甲醛溶液均勻混合，制備成混合乳化液。
1.2.2 初次致敏 根據(jù)豚鼠最大劑量試驗(yàn)方法的要求，對(duì)各組動(dòng)物采用相同處理方式皮下注射試劑: 在豚鼠背部剪毛4 cm×6 cm，消毒后于肩胛骨內(nèi)側(cè)從頭向尾成對(duì)地注射6個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.1 mL, 陰性對(duì)照組注射完全弗氏佐劑與9 g/L氯化鈉溶液的乳化液，陽(yáng)性對(duì)照組注射完全弗氏佐劑與甲醛的乳化液，粉劑組注射材料粉劑浸提液與完全弗氏佐劑等體積乳化物，混合物組注射混合物浸提液與完全弗氏佐劑的乳化液。
1.2.3 二次致敏 試驗(yàn)第7天同區(qū)域剪毛，100 g/L十二烷基硫酸鈉涂布各注射點(diǎn)，24 h后各注射點(diǎn)涂布相應(yīng)的被試液。
1.2.4 激發(fā)接觸 于二次致敏后第14天，在豚鼠腹部剪毛2 cm×4 cm，消毒后于皮內(nèi)注射相應(yīng)被試液0.1 mL，注射后24、48、72 h觀察注射點(diǎn)情況。
1.2.5 致敏性評(píng)價(jià) 按照皮膚反應(yīng)程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各注射點(diǎn)的反應(yīng)程度記分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:無(wú)紅斑水腫記為0分，輕度紅斑水腫記為1分，中度紅斑水腫記為2分，嚴(yán)重紅斑水腫記為3分，紫紅色斑并有焦痂形成、重度水腫、皮膚隆起記為4分。
皮膚致敏試驗(yàn)以致敏率表示致敏的程度, 致敏率是反應(yīng)評(píng)分為1分或以上的動(dòng)物數(shù)占該組動(dòng)物總數(shù)的百分比，即致敏率=致敏動(dòng)物數(shù)/動(dòng)物總數(shù)×100%。并按Mafhusson 致敏率分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：致敏率0～8% 為Ⅰ級(jí)，弱致敏物；致敏率9%～28%為Ⅱ級(jí)，輕度致敏物；致敏率29%～64% 為Ⅲ級(jí)，中度致敏物；致敏率65%～80%為Ⅳ級(jí)，強(qiáng)致敏物；致敏率81%～100%為Ⅴ級(jí)，極強(qiáng)致敏物。
2 結(jié)果
陽(yáng)性對(duì)照組致敏動(dòng)物數(shù)為10只；陰性對(duì)照組致敏動(dòng)物為0只；粉劑組致敏動(dòng)物數(shù)為1只，致敏率為10%,按致敏率分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分度為Ⅱ度，為輕度致敏物；混合物組致敏動(dòng)物數(shù)為0只，無(wú)致敏性。
3 討論
在皮膚致敏反應(yīng)過(guò)程中，半抗原滲透入皮膚，與皮膚蛋白質(zhì)結(jié)合后具抗原性。皮膚內(nèi)的郎罕細(xì)胞將抗原傳遞給特異型淋巴細(xì)胞，其中具有長(zhǎng)壽命的記憶細(xì)胞在激發(fā)階段作為原始活性因子，以后再接觸同一抗原時(shí)，致敏的淋巴細(xì)胞釋放淋巴因子，吸引炎細(xì)胞至局部產(chǎn)生反應(yīng)，導(dǎo)致一系列有害反應(yīng)。本試驗(yàn)采用皮內(nèi)注射的方法減少了機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)待測(cè)材料的影響，可以重新組合致敏物，具有較高的可靠性，是致敏試驗(yàn)的首選方法。豚鼠最大劑量試驗(yàn)是國(guó)際上評(píng)價(jià)化學(xué)物引起皮膚致敏作用的經(jīng)典方法，在我國(guó)已列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)參照ISO 10993?10標(biāo)準(zhǔn)[2]，選用白色豚鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。豚鼠血清中含有豐富的補(bǔ)體，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中補(bǔ)體含量最多的一種動(dòng)物，其補(bǔ)體非常穩(wěn)定。因此，豚鼠皮膚對(duì)刺激反應(yīng)敏感，且其遲發(fā)性超敏反應(yīng)與人類(lèi)相似。其中2～3月齡、體質(zhì)量為350～400 g的豚鼠最適合用于過(guò)敏反應(yīng)的研究。
弗氏佐劑是免疫學(xué)上廣泛應(yīng)用的油類(lèi)佐劑，分為完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑兩種。完全弗氏佐劑是在不完全佐劑的基礎(chǔ)上加一定量的分支桿菌制成。它的高度佐劑活性是其他物質(zhì)難以相比的，可使正常狀態(tài)下無(wú)免疫原性的物質(zhì)成為免疫原，并能啟動(dòng)細(xì)胞免疫。完全弗氏佐劑作為一種增強(qiáng)免疫反應(yīng)的藥物，可以最大限度地放大免疫反應(yīng)的程度，對(duì)于材料致敏性的檢測(cè)有較高的準(zhǔn)確性、靈敏性和可靠性。
根管充填材料與活體組織接觸后，不可避免地會(huì)與體液、組織間液發(fā)生作用，對(duì)活體產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)選用9 g/L氯化鈉溶液作為浸提遞質(zhì)，使待測(cè)材料浸提液的性質(zhì)盡可能與實(shí)際情況相似。
本試驗(yàn)復(fù)方牡蠣糊劑未顯現(xiàn)出皮膚致敏性與該材料的性質(zhì)有關(guān)。羧甲基殼聚糖是殼聚糖分子中引入羧甲基得到的一種水溶性殼聚糖衍生物，它具有良好的生物相容性，并對(duì)多種口腔重要厭氧菌有抑制作用[3]。而且它可直接作用于骨母細(xì)胞，促進(jìn)其分化和骨礦物質(zhì)的合成，提高堿性磷酸酶的活性，加速骨基質(zhì)的形成和修復(fù)作用。在降低血糖水平方面也有顯著的作用[4]，在醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域正在日益得到廣泛的應(yīng)用[5]。在口腔醫(yī)學(xué)中，已有學(xué)者在研究其在齲病防治、蓋髓術(shù)和牙周病方面的應(yīng)用[6]。
牡蠣粉是海洋甲殼類(lèi)動(dòng)物牡蠣的外殼研磨所形成的粉劑。其主要成分是碳酸鈣，含多種微量元素與氨基酸的復(fù)合物，其組成與根管壁的成分相近，可提供大量的鈣離子。將牡蠣粉與羧甲基殼聚糖聯(lián)合應(yīng)用具備根管充填劑應(yīng)具備的一些特性，將其應(yīng)用于根管治療有著良好的理化性能和生物學(xué)基礎(chǔ)。
在本試驗(yàn)中，粉劑組中有個(gè)別位點(diǎn)出現(xiàn)輕微過(guò)敏反應(yīng)，這可能與牡蠣粉中成分多樣，而其中完全弗氏佐劑又最大限度放大了材料的致敏性，以及動(dòng)物對(duì)致敏原個(gè)體差異性有關(guān)。
本試驗(yàn)僅為該材料系列研究中的一部分，能否應(yīng)用于臨床，尚需通過(guò)其他的實(shí)驗(yàn)研究以對(duì)其進(jìn)行客觀綜合的評(píng)價(jià)而定。
【參考文獻(xiàn)】
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