生物超弱發光及其應用研究概述

生物超弱發光及其應用研究概述

　　關鍵字：生物 超弱發光

　　生物超弱發光(UltraweakorSuperweakbioluminescence)，簡稱超弱發光，又叫超弱光子輻射（UltraweakPhotonemission）、自發光（SpontaneousLuminescence）、超弱化學發光（UltraweakorsuperweakChemiluminescence）[1]。超弱發光是一種低水平的化學發光，發光強度極其微弱，僅為100-103hv/(s.cm2)，量子效率也很低，約為10-14-10-9，波長范圍為200-800nm[2-6]。實際上超弱發光早已為人所知，早在1923年，前蘇聯科學家G.Gurwitsh在有名的“洋蔥試驗”中就已發現了超弱發光現象[7]。但是，由于儀器條件的限制，直到1954年意大利人Colli等利用裝有光電倍增管的儀器才首次科學地證明了超弱發光現象[8]。到了六十年代，前蘇聯科學家對超弱發光進行了大量研究，Mamedov[9]對90余種生物的測定發現，除藍藻和原生動物外，所有生物都有不同程度的發光，證明了超弱發光的普遍性。Slawinska等更進一步，提出任何生命物質都存在著超弱發光現象[10]。到目前為止，人們已對于超弱發光的機理及應用開展了大量研究工作，取得了可喜成績，但都還有待進一步深入[3]。

　　我國超弱發光研究起步較晚，主要在應用研究上開展了一些工作。中國科學院生物物理研究所等單位在人和動物上進行了大量有益的研究[11-23]。七十年代末以來，甘肅農業大學等單位在農作物、豆科牧草、沙生植物和水果的抗生（尤其是抗旱性）鑒定上[24-43]進行了大量探討，農作物已涉及小麥、玉米、大豆等8種，其中對小麥、玉米研究最多。理化因子如稀土、特定電磁輻射、電離輻射、氧化劑及代謝抑制劑等對超弱發光的影響也已涉及[28、40、44、49]�？v觀這些年來我國超弱發光研究的歷程，總的來說取得了一定的進展和成績，但也存在著一些不足。這里僅就超弱發光的機理、測量、理化影響因素，及其在我國農業和醫學中的應用研究加以概括和總結，以便對過去的工作有一個總的了解和回顧，并為今后進一步研究提供有益參考。

　　1超弱發光的機理

　　代謝和核酸合成是生物超弱發光的兩主要來源，萌發綠豆中這兩者和約為96%[44]。代謝發光又主要來源于氧化還原等代謝過程，如脂肪酸氧化[50、51]、酚的醛的氧化、H2O2的酶解、花生四烯酸的氧化、兒茶酚胺和單寧的過氧化，醌的氧化裂解[4]、蛋白質和氨基酸的氧化[52]等。氧化劑D2O明顯增強血紅素蛋白的發光強度[49]、呼吸抑制劑NaN3對萌發綠豆超弱發光的抑制達72%[44]等都是極好的例證。關于代謝發光的機理，Valadimirov曾提出過酶反應機制學說，認為它來源于代謝產生的過氧化物的酶解；但現在一般認為代謝發光是不飽和脂肪酸氧化產生的過氧化自由基復合后形成的三重態過氧化物退激所致[4]Wright.J.R等研究發現，脂肪酸的最大發光值提取物對超弱發光和脂肪酸氧化酶相似的抑制作用；脂肪酸氧化酶抑制劑Co2+、Mn2+、Hg2+和EDTA同樣也抑制超弱發光[53]，證明脂肪酸氧化是超弱發光的主要來源之一。核酸DNA和RNA的合成反應是超弱發光的另一個來源，它在綠豆種胚超弱發光中約占24%[44]。關于核酸的超弱發光，Popp等提出過DNA光子貯存假說和分化的物理模型[54，55]。Rattemeyer等根據溴化憶錠對超弱發光的影響，也初步證明了DNA是一個超弱發光源[56]。馬文建等還對DNA發光特異性進行了研究[57]，結果表明在所有堿基中只有鳥嘌呤能夠發光，且發光強度與濃度（亦即DNA濃度）成正相線性關系。該研究還發現，鳥嘌呤衍生物發光強度因取代基不同而不同，鳥嘌呤＜鳥嘌呤核苷＜脫氧鳥嘌呤核苷＜一磷酸鳥苷＜三磷酸鳥苷＜脫氧一磷酸鳥苷＜脫氧三磷酸鳥苷；甲基化對發光有抑制作用，O6甲基化和N7甲基化鳥嘌呤核苷酸的發光強度僅為正常核苷酸的15%，毛大璋等研究了核酸代謝抑制劑對萌發綠豆超弱發光的影響[44]。他們發現，雖然蛋白合成抑制劑環已亞胺通過抑制蛋白質合成中的移位酶迅速阻斷了細胞質中的全部蛋白質合成反應，但并沒有對超弱發光產生影響。因此，蛋白質合成過程對超弱發光沒貢獻。并由此推斷出，核酸代謝抑制劑放線菌素D之所以抑制超弱發光是因為它抑制了DNA發光和/RDA合成。因此，DNA和/RNA合成是超弱發光的一個來源。關于物理因素引起的超弱發光，Sapezhinskii等認為，是這些環境因素作用下生物體內產生的各種自由基（尤其是過氧自由基）經過一系列反應后生成的單線態氧和激發態羥基退激發光[58]。

　　2我國農業中的超弱發光應用研究

　　2.1作物的超弱發光特征

　　作物幼苗不同器官間超弱發光強度有差異，根（或胚根）發光最強[28，33，38，39]，因為種子萌發后細胞分裂活動主要集中在胚根的分生區[24]。于這一點，國外有類似報道，對小麥、菜豆、扁豆和玉米的研究顯示，根的發光強度是莖的的10多倍[8]。但也有例外，在玉米根、芽、胚、種中，芽的發光強度最大[31]。對大豆的研究顯示，子葉的發光強度高于真葉[61]，究其原因，子葉是苗期養分的主要來源，而真葉才剛開始生長。作物萌發過程中，超弱發光的動脈變化呈現單峰曲線[31，32，35，58]，中期發光強度萌發比前期和后期高出2-3倍[32]，發光量在總發光量中占絕大部分[35]。但有的研究也顯示萌發過程中發光強度呈雙峰曲線；并認為第一峰主要與營養物質的分解代謝（主要是不飽和脂肪酸的氧化）有關，第二峰主要與有絲分裂有關，兩者同行并存；但峰值出現的早晚因作物種類而不同[28，60]。不同物物間超弱發光強度有所不同，比如苗期發光強度大麥＞小麥＞玉米，反映了它們在干旱適應性上的差異[37]。種子超弱發光強度與某些物質的含量有關，豆科牧草種子萌動之初，超弱發光強度與干種子中飽和脂肪酸C014-18、棕櫚酸、ATP含量呈負相關，和雙健不飽和脂肪酸C1-318-24含量成正相關[38，39]，這和一些沙生植物是一致的[41]。作物籽粒的發光強度與成熟度及著生部位有關，對玉米的研究表明，成熟度小的籽粒高于成熟度大的籽粒[61]。其原因在于，授粉初期籽粒主要器官分化，細胞分裂和呼吸作用強；進入完熟期后，籽粒新陳代謝和細胞分裂減弱，超弱發光也相應減弱。此外，不同著生部位的籽粒超弱發光強度也有所不同，授粉48天后的玉米果穗，上部籽粒＜中粒籽粒＜下部籽粒；采后貯存30天的果穗，發光趨勢正好相反，前者反映了果穗的發育和成熟過程，后者則反映了玉米是穗收獲后穗部營養物質轉運和累積的規律。

　　2.2缺失體和種子活力

　　三種大豆脂肪酸氧化酶同工酶缺失體Lox1、Lox2、Lox3及其組合缺失體的子葉和真葉有相同的發光規律，雙缺失體＞單缺失體＞正常品種，表明缺失體苗期葉片的超弱發光與脂肪酸氧化酶的基因型有關，這也許可以成為鑒別脂肪酸氧化酶同工酶缺失體的指標[59]。國外對這三種缺失體也有研究，據Jinyewang等報道，三者及組合的組織勻漿中，Lox1+Lox3的發光強度最低[61]。種子超弱發光強度的高低能在一定程度上反映種子活力的大小，馬鈴薯整種子及其粉碎后的提取液超弱發光強度均與發芽率和發芽指數呈顯著或極顯著正相關關系[25]。用超弱發光強度鑒定種子活力，樣品量少又不破壞種子，對于種子量少的珍貴品種極其有益。

　　2.3抗生研究

　　2.3.1抗穗發芽能力、抗冷性、抗鹽堿不同抗穗發芽能力小麥品種完熟期貯藏幼苗的超弱發光強度有相同趨勢，休眠期短的品種（易帶穗發芽）＞中抗品種＞抗性品種[26]。因此，籽粒超弱發光強度可作為鑒定和篩選抗穗發芽品種的依據。只要把品種按發光值和統計結果排列，即可把抗性品種和抗性差的品種分開，而且條件單一，不需模擬逆境。

　　低溫能降低超弱發光強度，低溫下萌動7-8天的玉米籽粒[24]發光強度不及室溫下的三分之一；且同樣的低溫，抗寒品種發光強度顯著高于不抗寒品種，這種低溫萌動時品種間發光強度的差異性品種抗冷性一致的表現，為篩選抗寒品種提供了一種簡捷的鑒定方法。稀土有利于提高根系活力和發光強度[40]。但稀土只是在作物自身抗寒基礎上發揮效力。隨著溫度的下降可能出現類似“閃光”的現象，比如冬天小麥在（40C-O0C-40C）降溫過程中，根系活力隨之下降，根系超弱發光強度好反而有所提高。水果對低溫的反應和萌發強度卻反而有所提高。水果對低溫的反應和萌發種子有所不同，將葡萄和金拮分別貯藏在低溫和室溫下，結果，在貯藏過程中發光強度沒有顯著變化，而且兩種處理亦無顯著差異[42]。

　　用NaCI溶液對種子進行鹽分脅迫處理，結果顯示，高抗鹽品種的發芽率和超弱發光強度均高于敏感品種[28，40，43，60]，耐鹽苜蓿的發光值、代謝和生長速率無大的變化，敏感品種則有顯著改變[60]。鹽分脅迫將降低超弱發光強度，用0.5%naCI溶液萌發的大麥發光強度顯著低于對照無顯著差異，大豆則差異明顯，這是因為小麥屬中抗鹽作物，而大豆屬不抗鹽作物[43]。稀土能提高作物耐鹽能力，稀土溶液浸種能減弱鹽脅迫引起的春、冬小麥發光強度降低的程度，且冬小麥比春小麥效果更明顯[40]。

　　2.3.1抗旱性作物籽粒和幼苗超弱發光都能在一定程度上反映品種間抗旱性差異。不同抗旱性小麥品種籽料的發光強度各有一定的范圍，且抗旱性越超弱發光值也越高[30]，這與冬小麥和蕎麥幼苗的試驗結果是一致的[32，36]。用籽粒的超弱發光強度來鑒定作物的抗旱性有許多優點，簡單易行，速度快，樣品量少，又不破壞種子，對種子量少的珍貴品種尤其適宜。但是，僅僅根據超弱發光值的方差分析結果來對品種進行抗旱性分類，則無論用LSR0.05還是用LSR0.01作為分類標準，其中都有可屬于抗旱性中等的中間類型[30]。

　　蕎麥幼苗的發光強度抗旱品種大于不抗旱品種[36]。玉米抗旱自交系根的超弱發光積分值高于不抗旱自交系；根芽、根胚、根種超弱發光積分值的比值，萌發前期抗旱自交系大于不抗旱自交系（超弱發光積分優值與總積分值的比值亦如此）；后期則相反[31]，大麥超弱發光的最高峰值亦有類似規律[35]。冬小麥抗旱品種萌發過程五個齡期的的超弱發光總值比不抗旱品種大（大麥[35]也是這樣），超弱發光持續不衰時間也比不抗旱品種長[32]。芝麻幼苗根莖，根葉超弱發光的的比值，抗旱性品種比不抗旱品種高[33]。（辣椒[34]、小麥[40]）萎蔫后的復水能力與超弱發光強度呈正樣關系，這在評價品種抗旱能力方面有實際意義[40]。不同抗旱性品種在萌發過程中有不同的發光動態，（小麥、大麥[37]）抗旱品種萌發初期芽和根的超弱發光都很強，第二葉比第一葉發光水平更高，且在整個萌發過程中根的發光長盛不衰；不抗旱品種第一、二葉的發光水平都比較低，雖然萌動之初根的發光值占極大比重，但短時間內又很快下降；中抗品種則介于兩者之間。這種發光部位動態過程的不同，有可能成為快速鑒定、早期篩選抗性品種的一種簡便方法。

　　此外，人們還對水分脅迫和模擬干旱條件下作物幼苗的發光情況進行了研究。小麥萌發過程中用20%聚乙二醇進行水分脅迫處理，2小時后發光值有所下降，此后一直趨于較低水平，并且無明顯的峰值出現[28]。（小麥、大豆和玉米等[27，29]）作物種子萌發時用蔗糖模擬干旱（簡稱模擬干旱），超弱發光強度有所降低；但不抗旱品種降低程度顯著大于抗旱品種。在模擬干旱條件下萌發時，發光強度抗旱品種顯著高于普通品種與蒸餾中萌發情況相反[29]。

　　2.4理化因素對超弱發光的影響

　　超弱發光強度與環境因素有關，理化因子，如特定電磁波（簡稱PDP）、氧化劑、代謝抑制劑、稀土和電離輻射等，都可以改變發光強度。經TDP輻照的大豆干種子，在整個萌發過程中，超弱發光值始終高于未輻射種子[45]，這與TDP輻射能提高種子活力，促進種子萌發，促進幼苗生長，增強萌發種子的代謝活動是一致的。（水稻、陸稻、小麥、玉米和蘿卜等[48]）作物種子剛經TDP輻照完時，發光強度較高，但不穩定；照后放置24小時此現象即可消除。TDP也對精子的超弱發光有影響[46]，家兔精子經TDP輻照后孵育，結果，發光值均高于對照，其中8分鐘對照組與對照組差異極顯著。加氧化劑是增強發光的又一方法。小麥種子[28]萌發過程中，分別于6小時和72小時用1%KMnO4溶液處理，發光強度可分別增加10.8%倍和2.5倍，增強幅度隨萌發時間的延長而減小，這是因為，代謝的氧化底物隨著萌發時間的推移而減少。在血紅素蛋白研究中也發現了氧化劑對發光的增強作用，D2O2能明顯增強血紅素蛋白的發光強度；自由基清除劑則產生相反的作用一抑制超弱發光，但不同自由基清除劑間有差別，B-Car，對血紅素蛋白的發光有很大的抑制作用，而甘露醇和苯甲酸鈉則無甚功效[49]。稀土能提高（液體培養的玉米、冬小麥、辣椒和甜菜等[40]）根的超北發光強度和活力，但稀土只在一定范圍內起作用，遺傳特征是發光特征及根系活力的決定因素。

　�。ㄗ贤饩�[47]、X-射線、r射線[63]等）電離輻射也能提高超弱發光的強度。經X-射線照射后V70細胞發光強度明顯增強，累積照射26.5GY，超弱發光總超弱發光峰值出現的位置，輻射細胞和未輻射細胞的發光峰均在634.6nm出現。用X射線或r-射線照射CHO細胞和V79細胞，當輻射劑量小于26.5GY時，超弱發光強度與輻射劑量性相關。輻射增敏劑Misonidazole能增加X-射線和r-射線誘發的發光強度，但不變發光強度一輻射劑量間的線性關系；另，僅含Misonidazole的培養液的發光有受輻射因素的影響。紫外線對超弱發光具有促進和抑制兩種可能作用，經紫外線照射10分鐘的大豆種子萌發后光峰值和發光均值都比對照高將近兩倍，而照射60分鐘的大豆種子反而明顯低于對照；加入冷光劑后發光作用得到了加強，但發光趨勢不變[47]。

　　對萌發綠豆的研究顯示，不同代謝抑制劑對超弱發光有不同的影響[44]。NaN3抑制大部分與氧化有關的發光，放線菌素D（AD）則抑制與核酸合成有關的發光。呼吸受抑制引起的ATP等的缺乏必然會降低核酸的合成速度，因此，AD和NaN3對超弱發光的抑制既各不相同，又相互影響部位不同。EB是插入DNA分子使DNA雙螺旋結構解開從而引起超弱發光增強；AD則主要是通過抑制RNA的合成抑制超弱發光。此外，EB能消除AD對發光的抑制，但不影響NaN3和AD聯合處理對發光的抑制。

　　3超弱發光在人體和運行研究中的應用

　　人體體表不同部位超弱發光強度有差異，手指＞手心＞面頰[13]，僅就手而言，指尖＞手心＞虎口＞手背[11]。人體體表有14條高發光線，其中92.97%與《靈樞經》中描繪的人體十四經的體表經穴、經線的高發光生物物理特性。病人某些部位的發光強度不對稱，如單側顏面神經麻痹和面肌痙攣者的左右商陽穴[11]。不同刺激劑對人外周血多形核白細胞（PMN）發光的刺激作用有別[15]，酵母多糖（OZ）和伴刀豆球蛋白刺激效率低，持續時間短；佛發波醇刺激效率高，低濃度即能使PMN穩定發光達6小時。另外，測量體系中血含量也對PMN受激發光有影響，105左右含血量最佳。針刺能增加動物某些穴位發光強度，對家兔的研究[12]顯示，電針刺外關穴前后同側耳部發光強度有顯著差異；而針刺非經穴部位，未見明顯變化，驗證了祖國醫學外穴與耳部位存在特殊的三焦經經絡通路的論述，以及經穴對機體生命活動特有的調整作用。該研究還發現，用藥物封閉周圍神經通路后，電針刺激不能明顯改變發光強度，證明在經絡激動劑和抑制劑對超弱發光有相反的作用。fMLP、A2387等均可刺激大鼠腹腔中性粒細胞和次黃嘌呤一黃嘌呤氧化酶系統發光[23]。超弱發光在癌癥研究中也得到了應用，畸胎癌組織抽提液的發光峰值603nm和651nm與原卟淋IX標準樣品基本吻合，證明畸胎癌組織中有卟啉[21]。另一項研究還發現，卟淋和白蛋白復合物的發光特性與臨床診斷中選擇的癌固有特征峰或患者血清特征峰相吻合[22]。超弱發光在國內經絡研究上應用較多，目前已在循經感傳與經穴發光的定量關系、人體體表冷光變化與針刺對人體的調節作用、以及喻穴、特定穴、交會穴、子母穴的冷光特性等研究中取得初步進展，部分驗證了祖國醫學的有關經絡學說[12]。

　　兔和大鼠[16，17]油酸肺損傷時H2O2能顯著提高發光值和降低發光衰減系數。經H2O2處理的兔血漿發光強度明顯高于全血和紅細胞懸液；但溶血后三者的發光值均顯著增加，其中全血和紅細胞懸液發光值分別增加了15.5倍和6.1倍。白細胞降低90%后油酸性肺損傷發光值的升高程度顯著減小，支氣管肺泡藻洗液中蛋白含量和化學發光水平也顯著降低，表明白細胞在肺內聚集將加重肺損傷程度。離體的不同發育時期的雞胚神經細胞的發光有很大差異[19]，9天以后的雞胚神經細胞有明顯的特征曲線，該曲線的產生與外界的溫度、氧、電場作用和光照等因子有關。溫度由410C降到370C過程中，發光強度亦降低，同時最大峰位置后移，但當溫度低于370C時，則特征曲線變得不明顯；外界電場和光照能使發光迅速增加，但不能改變發光曲線的特征，且移去外電場后，能迅速恢復到原發光水平。苯對水介質中鯉肝微粒體的發光有增強作用，但需要適量過渡金屬離子F2+或Cu2+存在；F2+誘導活力比Cu2+大，所用劑量僅為Cu2+的1/6，且兩者的作用方式也有區別，F2+所刺激的肝微粒體發光是陡升陡落，Cu2+則是緩升緩降[19]。超弱發光與許多生理生化反應有關，對綿羊精子的研究發現，發光強度與活力、呼吸、果糖酵解、磷酸肌酸呈正相關，這種發光與活力和能量代謝間的內在聯系，反映了精子能量轉化過程，是評價品質很有價值的指標[20]。

　　4超弱發光的測量

　　現在簡要談一下檢測方法和檢測系統[4]。超弱發光的測定主要是基于光電倍增管的檢測方法，共有測量輸出電流（DC法）、測量輸出電流中的交流成分（AC法）、單光子計數（SPC法）和同步單光子計數（SSPC法）等四種方法，其優越性為DC法＜AC法＜SPC法＜SSPC法，但現在常用的主要是后兩種。常用的檢測系統有，BCL發光測定儀、Beckman公司生產的LS-5801、LS-9800液體閃爍計數器的單光子計數裝置，以及EM19789QB型、EM19635QB型、GDB-52型等光電倍增管裝配的儀器。

　　光致發光和溫度對超弱發光的測定有很大影響。超弱發光通常包括光致發光和自發發光，但光致發光比自發發光的成分強得多[5]，因此必須消除光致發光的影響。消除光致發光有多種發光有多種方法，通常是測量暗避光處理，測量時避光。暗避光時間的長短，不同試材有所不同，萌發馬鈴薯種子需要5小時[25]。3T3細胞[5]和小麥幼苗、淡水蚤[2]需要1-2小時，大鼠血液[5]、CHO細胞[45]、萌發綠豆種子[5，44]都很短，僅需幾分鐘。溫度對超弱發光也有影響，發光強度隨著溫度的升降而增強的減弱[24]、，將樣品放入比它低幾度的樣品室中，5分鐘后，與溫度不平衡相關聯的可衰減發光就只剩下了近1/4[44]。還有人認為，為了降低光電倍增管的本底，提高信噪比，需將光電倍增管冷卻到300C或更低。由于超弱發光太弱，有必要增強發光以利于測定。增強超弱發光的方法很多，如引入活化劑、H2O2，以及通過電流等，現在主要是向樣品中加入新配制的冷光劑[31-33，37-39，45，63]。輻照處理時可同樣加入輻射增敏劑，對活細胞CHO和V79的研究表明輻射增敏劑Misonidazole能增強超弱發光強度[63]。

　　綜上所述，經過二十余年的努力，我國在生物超弱發光，尤其是農作物的抗逆研究中，已取得了可喜成績和進展，這為我國生物超弱發光的進一步深入研究打下了基礎，對于后繼者也是一個很大的策動力，但應該看到的我國超弱發光的研究領域尚存在一些問題，值得大家關注。主要集中在應用研究上，我們認為今后應強化這方面的工作，機理的研究能推動應用研究，并為應用研究提供堅實的理論基礎。在應用研究方面，尤其是作物抗性研究方面有必要拓寬范圍和增加深度。在抗逆研究中，目前已有的結果大都僅僅反映了超弱發光與作物抗逆性之間的定性關系，沒有量化。筆者以為，每種作物都應測量盡可能多的不同抗逆性的品種，然后在超弱發光指標與抗逆性之間建立定量關系，即數學模型。有了這樣的模型，對于一個抗逆性未知的樣品，只要測出它的超弱發光指標，即可得出其抗逆性大小，也只有這樣，超弱發光在抗逆研究中才能真正發揮作用。此外，還應將超弱發光機理與作物抗逆性機理聯系起來研究，而不是僅著眼于兩者的表面聯系，這樣才能從更深的層次探索兩者的本質聯系，使超弱發光及其應用研究向前跨一大步。

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