醫(yī)學(xué)護(hù)理論文推薦
紅景天屬植物的根及根莖［1］，我國(guó)紅景天資源大多分布在高寒地區(qū)。其有效成分主要是紅景天苷及其苷元-酪醇，二者均具有抗缺氧、抗疲勞、抗微波輻射、抗病毒、抗腫瘤等作用。紅景天制品是抗高原反應(yīng)的必備品。隨著紅景天產(chǎn)品廣泛開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，過(guò)度采挖使天然資源日趨枯竭［2］，對(duì)高原藏區(qū)生態(tài)環(huán)境的破壞嚴(yán)重。因此，保護(hù)性開(kāi)發(fā)野生資源，提高紅景天有效利用率顯得更加重要。在其他一些植物藥材中，苷是從無(wú)活性的苷元脫去糖基獲得的，可以采用酸解或酶法來(lái)水解糖基，簡(jiǎn)便易行。與之不同，紅景天苷和苷元生成是合成代謝，其前體來(lái)源不太清楚，從而造成提高其有效成分研究的難度。
目前已有的研究主要包括：添加前體物和酶催化劑合成紅景天苷、化學(xué)合成法［3］、植物細(xì)胞組織培養(yǎng)和基因克隆等方法［4,5］，但與應(yīng)用還有不小距離。文章在前期研究中，已分離到對(duì)紅景天苷具有轉(zhuǎn)化能力的菌株，通過(guò)單一菌株發(fā)酵，最高可使紅景天原藥材中苷含量提高52.83%。本研究進(jìn)一步采用雙菌株協(xié)同發(fā)酵紅景天，使其中苷含量大大高于單一菌株發(fā)酵。混合菌株發(fā)酵提高紅景天苷和酪醇含量研究還未見(jiàn)報(bào)道，為利用生物技術(shù)提高野生藏藥材資源利用率提供新途徑。
通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到紅景天發(fā)酵最佳條件為；接種量10％、固液比1∶10、生長(zhǎng)時(shí)間60 h。試驗(yàn)結(jié)果表明，接種量過(guò)大時(shí)，菌體之間相互纏繞，不利于菌體的發(fā)酵；固液比過(guò)低，發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)成分過(guò)低，限制菌體生長(zhǎng)；時(shí)間太短，影響前體的產(chǎn)生和紅景天苷及酪醇的合成。
最優(yōu)發(fā)酵條件下雙菌株發(fā)酵液中紅景天苷和酪醇含量分析按照以上確定的最佳發(fā)酵條件，即：菌絲體接種，接種量10%，雙菌株的混菌比例為2∶8，配料水比為1∶10，30℃ 200 r·min-1條件下轉(zhuǎn)化發(fā)酵60 h，以紅景天原藥材提取液以及單菌發(fā)酵的提取液作對(duì)照。單菌和雙菌發(fā)酵提取液均與原藥材提取液的測(cè)定稀釋度相同（含相同原始質(zhì)量的紅景天原藥材）。用HPLC檢測(cè)紅景天苷和酪醇并測(cè)定含量，結(jié)果如圖3～6。
由圖4～6的HPLC色譜圖顯示，紅景天原藥材提取液、單株菌發(fā)酵和雙菌株發(fā)酵的提取液中，在3.8min和11.2min均出現(xiàn)吸收峰，紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品和酪醇標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致。35-42雙菌株發(fā)酵的吸收峰面積明顯大于原藥材對(duì)照以及單株菌發(fā)酵液的吸收峰面積。HPLC測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表6，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)35-42雙菌株發(fā)酵后，紅景天中紅景天苷含量提高86.29%，酪醇含量提高118.14%，總有效成分提高94.68%。
接種方式的確定將7種雙菌株組合分別采用孢子懸液和菌絲體進(jìn)行接種發(fā)酵，用重氮鹽比色法測(cè)定紅景天總有效成分的含量。由表3可以看出，以孢子懸液接種發(fā)酵，發(fā)酵提取液吸光度平均值為0.522，而以菌絲體接種，發(fā)酵提取液吸光度平均值為0.561，后者約是前者的1.055～1.120倍。表明用菌絲體接種優(yōu)于孢子懸液。在這兩種接種方式中，均以35-42菌株組合最好，因此選定該雙菌株組合作進(jìn)一步試驗(yàn)。
本研究通過(guò)篩選微生物雙菌株對(duì)紅景天原藥材進(jìn)行發(fā)酵，可以顯著增加紅景天苷和酪醇的含量。微生物具有豐富的代謝多樣性和很強(qiáng)的代謝能力，高等植物體內(nèi)所有的代謝途徑，在微生物中都有可能存在并且活性更強(qiáng)。 在紅景天苷合成中，通過(guò)苯丙烷類(lèi)代謝途徑，為酪醇的合成提供含苯環(huán)的碳架結(jié)構(gòu)，再由轉(zhuǎn)移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖與酪醇與合成紅景天苷。
本研究所用真菌與紅景天同屬真核生物，能催化前體轉(zhuǎn)化為紅景天苷和酪醇，可能具有與紅景天中類(lèi)似的部分酶及代謝途徑，并能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等胞外水解酶，在紅景天原料上生長(zhǎng)時(shí)，分解植物組織，促進(jìn)物質(zhì)的溶出，產(chǎn)生更多的前體物，為紅景天苷和苷元合成提供充足的物質(zhì)來(lái)源。紅景天苷和苷元的合成需要多種酶的催化，而單一菌株很難在多個(gè)環(huán)節(jié)上同時(shí)提高中間代謝物的量。雙菌株發(fā)酵中，酶系比例相對(duì)協(xié)調(diào)，形成代謝協(xié)同作用，使紅景天苷含量大大提高。
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