腸道微生物組的現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法綜述
傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的研究方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)是目前主要的兩大研究手段，以下是小編搜集的一篇關(guān)于腸道微生物組的現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法探究的論文范文，歡迎閱讀查看。
引言
微生物遍布于人體所有與外環(huán)境相通的器官。成人胃腸道黏膜表面積達(dá)300m2,是與外界環(huán)境接觸并相互作用的最大區(qū)域，在其中定殖著約1×1014個微生物，數(shù)量是人體體細(xì)胞總數(shù)的10倍。腸道微生物參與宿主的能量吸收和儲存，幫助宿主降解并吸收食物中的營養(yǎng)成分，還能促進(jìn)免疫細(xì)胞分化與成熟、激活腸道免疫系統(tǒng)[1-3],具有非常重要的生理意義。但是由于人體腸道復(fù)雜的厭氧環(huán)境，40%~80%的腸道微生物難以在體外培養(yǎng)，僅憑培養(yǎng)手段進(jìn)行微生物組研究會大大削弱腸道微生物的多樣性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，利用分子生物技術(shù)研究腸道微生物組的技術(shù)取得了極大的進(jìn)展。掌握并運(yùn)用這些新技術(shù)對腸道微生物組的研究十分關(guān)鍵，該文主要對腸道微生物組的現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法進(jìn)行總結(jié)和介紹。
1傳統(tǒng)純培養(yǎng)檢測方法
傳統(tǒng)微生物檢測方法是用各種培養(yǎng)基培養(yǎng)分離微生物，并通過革蘭染色、生物化學(xué)和血清學(xué)試驗等方法來確定微生物種類，通過倍比稀釋、菌落計數(shù)等方法來測定微生物數(shù)量。但由于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)中，菌株的富集或衰減不可避免，原始的微生態(tài)結(jié)構(gòu)被改變，這會導(dǎo)致研究結(jié)果存在較大偏差。
Moore等[4]利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對20例男性的糞便樣品中微生物種類和相對數(shù)量進(jìn)行了研究，研究對象包括日本到夏威夷的60~80歲的健康個體，食譜包括東西方飲食，將取到的糞便樣品進(jìn)行培養(yǎng)分析，得到1147個純培養(yǎng)物，鑒定為113種不同的微生物。然而據(jù)報道，人體腸道至少存在400種微生物[4],因此這種培養(yǎng)方法會漏掉多數(shù)的、營養(yǎng)條件要求更為苛刻的微生物。
2傳統(tǒng)分子生物技術(shù)
2.1腸道菌群DNA提取技術(shù)
從糞便樣品中提取高質(zhì)量的、具有代表性的腸道菌群總DNA是腸道微生物分子生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)。目前提取腸道菌群總DNA的方法主要有酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、GuSCN/silica法以及一些商業(yè)試劑盒，如FastDNAkit、QuantumPrepAquapureGenomicDNAisolationkit、QIAampDNAStoolMinikit等。其中QIAampDNAStoolMinikit的提取效果得到較多肯定。試劑盒應(yīng)用方便、快捷，但價格昂貴，處理大批樣品時科研成本太高。相較而言，酚/氯仿抽提法快速且成本低，適合用于腸道微生物研究中總DNA提取，尤其適合處理大批量樣品。
2.2構(gòu)建基因文庫測序技術(shù)
2.2.1構(gòu)建16SrRNA基因文庫
16SrRNA基因克隆文庫通過擴(kuò)增各種細(xì)菌共有基因序列片段對細(xì)菌進(jìn)行定性定量分析，是一種有力的細(xì)菌學(xué)檢測分析手段，現(xiàn)已廣泛用于腸道和人體其他部位微生物多樣性研究[5-7],并通過該方法發(fā)現(xiàn)了許多尚未培養(yǎng)到的菌種。16SrRNA基因克隆文庫技術(shù)可以分析標(biāo)本中的菌群結(jié)構(gòu)，反映各種細(xì)菌的相對比例及數(shù)量，具有培養(yǎng)法難以比擬的優(yōu)勢，不足之處是實際操作中技術(shù)環(huán)節(jié)多、影響因素復(fù)雜、不同實驗室操作條件難以標(biāo)化以及對標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)量有一定要求等。但相信隨著技術(shù)的不斷提高，16SrRNA基因序列分析將逐步成為微生物組結(jié)構(gòu)研究的有力工具。
2.2.2全基因組鳥槍測序分析技術(shù)
Gill等[8]利用全基因組鳥槍(Shot-gun)測序技術(shù)分析了兩名健康成年人糞便中的菌群，首次對人體腸道微生物多樣性進(jìn)行了全面的描述。
Qin等[9]運(yùn)用深度Shot-gun測序法研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型糖尿病患者的腸道菌群中度失調(diào)，產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌豐度降低，而致病微生物的功能增加。相較于傳統(tǒng)的基于rRNA的研究，Shot-gun測序分析技術(shù)可以找到更多的進(jìn)化標(biāo)記，得到更多的菌群信息，且Shot-gun技術(shù)不需PCR擴(kuò)增，因此分析出的結(jié)果偏差較小;此外，通過序列數(shù)據(jù)分析，還可以對微生物基因表達(dá)及功能狀態(tài)情況進(jìn)行研究。其缺點在于微生物系統(tǒng)組成復(fù)雜，將大量的序列信息正確地裝配成每個成員的基因組全序列，是一個較大的難題。
2.3遺傳指紋圖譜技術(shù)
構(gòu)建基因文庫的方法可以得到樣本中的菌群種類和相對進(jìn)化信息，然而，我們常需要對整個腸道微生物組進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，構(gòu)建基因文庫方法會顯得費(fèi)時、費(fèi)力，不能做出快速檢測，這時遺傳指紋圖譜技術(shù)可克服上述不足，快速靈敏地檢測生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)變化。
2.3.1變性梯度凝膠電泳及其衍生技術(shù)
變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgelelectrophore-sis,DGGE)技術(shù)是由Fisher等發(fā)明的，Muyzer等首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究，隨后Zoeten-dal將其用于人體腸道菌群的分析研究。后來在其基礎(chǔ)上衍生出溫度梯度凝膠電泳(temperaturegra-dientgelelectrophesis,TGGE)、瞬時溫度梯度電泳(temporaltemperaturegradientgelelectrophesis,TTGE)、脈沖場凝膠電泳(pulsedfieldgelelectro-phoresis,PFGE)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(single-strandedconformationalpolymorphisms,SSCP)等。此后，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于消化道排泄物中微生物的分析[10-11].
DGGE及其衍生技術(shù)既可以對比分析不同的微生物群落之間的差異，鑒別細(xì)菌種類，也可以研究同一個微生物群落隨時間和環(huán)境改變的動態(tài)變化過程。但該技術(shù)用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，可能會忽視一些數(shù)量較少的細(xì)菌，并且腸道微生物組種類繁多，最終獲得的電泳條帶復(fù)雜且擁擠，增加了結(jié)果分析的困難。
2.3.2隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性
DNA技術(shù)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技術(shù)利用寡核苷酸序列在基因組上隨機(jī)配對的特性，經(jīng)擴(kuò)增得到一系列大小不同的產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳便可得到一系列基于RAPD的指紋圖譜。因為不同模扳DNA產(chǎn)生的指紋圖譜有差異，因此可用于鑒定微生物種類，并且靈敏度高，常被用于細(xì)分微生物組內(nèi)的種群差異[11-12].
RAPD技術(shù)的缺點在于重復(fù)性和穩(wěn)定性差，產(chǎn)生的圖譜條帶過于復(fù)雜，需要進(jìn)行大量的篩選，從中找到較為合適的引物進(jìn)行分析，較為費(fèi)時。
2.3.3末端限制性片斷長度多態(tài)性分析技術(shù)
末端限制性片斷長度多態(tài)性分析(terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphisms,T-RFLP)技術(shù)通過自動測序儀分析酶切后的末端序列，達(dá)到定量的目的，因為末端序列來自16SrDNA,因此可用于復(fù)雜的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的研究，快速靈敏地評估群落中微生物的多樣性，并給出微生物群落結(jié)構(gòu)的指紋圖譜，是目前被廣泛采用的一種指紋圖譜技術(shù)，現(xiàn)已成功應(yīng)用于各種微生物群落結(jié)構(gòu)和多態(tài)性的比較分析[13-14].
其缺點在于該技術(shù)只檢測末端序列，因此不可避免地會低估微生物群落結(jié)構(gòu)多態(tài)性。同時它是基于PCR擴(kuò)增技術(shù)，實驗過程影響因素較多，亦會對結(jié)果造成影響。
2.4熒光原位雜交技術(shù)
除了上述技術(shù)外，分子雜交技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于腸道微生物組的研究中，同樣表現(xiàn)出應(yīng)用潛力和優(yōu)點。
Giovannoni等首次應(yīng)用熒光原位雜交(fluo-rescenceinsituhybridization,FISH)技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌學(xué)的研究。隨后Delong等使用熒光標(biāo)記寡核苷酸探針檢測單個微生物細(xì)胞。經(jīng)過不斷的豐富和完善，F(xiàn)ISH技術(shù)已成為近年腸道微生物研究中一種重要的檢測工具[15-16].其利用熒光素標(biāo)記16SrRNA基因序列的寡聚核苷酸探針，與靶細(xì)菌雜交，通過檢測目標(biāo)序列來鑒定微生物，具有敏感、快速、安全等優(yōu)點。
FISH技術(shù)還可用于鑒定和檢測未培養(yǎng)種屬和新種屬。其缺點在于FISH技術(shù)尚不能用于16SrRNA序列未知微生物的檢測，且在操作時易受到污染干擾，同時結(jié)果會受到微生物營養(yǎng)狀態(tài)的影響。
由于腸道微生物組種類繁多，而聯(lián)合流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)可進(jìn)行高通量分析，已越來越多地應(yīng)用于FISH信號檢測。
3新近發(fā)展的方法技術(shù)
3.1基因芯片技術(shù)
基因芯片技術(shù)(DNAchips)原理是使探針分子在濾膜、硅片、玻璃等介質(zhì)上排列成微矩陣，將待檢樣品標(biāo)記后與微矩陣雜交，通過檢測樣品雜交信號強(qiáng)度即可獲得樣品中基因序列及數(shù)量等信息，具有快速、高效、低成本等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的研究[17-19],并且其敏感性和特異性已經(jīng)得到了反復(fù)驗證[20-21].
目前尚沒有應(yīng)用基因芯片進(jìn)行人體腸道微生物研究的報道，但基因芯片包括大量針對人體腸道微生物的功能基因，并且其子類型HummChip是專門針對人體微生物設(shè)計的，因此基因芯片技術(shù)應(yīng)用于腸道微生物研究不存在技術(shù)問題。
3.2宏基因組學(xué)技術(shù)
宏基因組學(xué)即將環(huán)境中全體微生物的遺傳物質(zhì)看作一個整體，系統(tǒng)全面地研究微生物與其生存環(huán)境之間的關(guān)系。通過宏基因組測序技術(shù)可發(fā)現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，結(jié)合其代謝特征可分析腸道微生物與代謝性疾病之間的聯(lián)系。宏基因組學(xué)還可用來發(fā)現(xiàn)新發(fā)傳染病病原以及未知病原。美國國立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)的人類微生物組計劃[22-23]利用宏基因組學(xué)技術(shù)分析了242個美國健康志愿者微生物基因組，獲得了近800個菌種的基因參考序列。
宏基因組學(xué)技術(shù)為腸道微生物組的研究提供了新的思路與方法，為充分認(rèn)識和利用未培養(yǎng)微生物、完整地從群落水平上認(rèn)識微生物開辟了新的道路。
3.3第二代測序技術(shù)
2005年底Roche公司建立454測序技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合DNA擴(kuò)增乳膠和皮升級反應(yīng)孔進(jìn)行焦磷酸鹽測序，可對微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系進(jìn)行研究，具有速度快、通量高、讀長長、準(zhǔn)確性高、一致性好及簡便高效的優(yōu)勢。
Gosalbes等[24]運(yùn)用454測序技術(shù)對10位健康人的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)厚壁菌門占49.18%,擬桿菌門占31.42%,變形菌門占3.6%,放線菌門占0.4%.454測序技術(shù)在腸道微生態(tài)研究中已經(jīng)得到較為廣泛的運(yùn)用[25],然而454測序同樣存在著缺點，主要在于片段長度短，對連續(xù)單堿基重復(fù)區(qū)域測序準(zhǔn)確性差，常會產(chǎn)生缺失或者插入誤差。但隨著454測序分析技術(shù)的`發(fā)展成熟，終將得到更準(zhǔn)確、可靠的結(jié)果。
相較于454測序技術(shù)，Illumina測序表現(xiàn)出低錯誤率、低成本和高通量等優(yōu)勢[26-27].但是，Illumi-na測序長度短，所獲得的序列數(shù)量巨大，呈數(shù)十倍增長，原有生物信息學(xué)分析工具無法計算，因此解決其運(yùn)算問題是Illumina用于微生物群落分析的關(guān)鍵之處。隨著Illumina測序讀取長度的改善及新型分析工具的開發(fā)，預(yù)計Illumina測序技術(shù)將因其高性價比的優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于腸道微生物組的研究。
4展望
從1975年Woese等首次應(yīng)用rRNA分析菌群以來，rRNA數(shù)據(jù)庫迅速擴(kuò)大，16SrRNA基因作為細(xì)菌的標(biāo)志，已逐漸成為臨床細(xì)菌分類、鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)多以16SrRNA基因為基礎(chǔ)，Shot-gun測序費(fèi)用高昂且分析過程繁瑣復(fù)雜，目前難以大規(guī)模推廣使用，DGGE技術(shù)相對簡單高效，T-RFLP較為方便快捷�；蛐酒糜趥�體間腸道菌群對比時靈敏性較好，且具有高通量特點，預(yù)計可廣泛應(yīng)用于臨床檢驗。宏基因組測序可保留樣本中全部菌群的信息，在腸道菌群多樣性研究中正逐漸盛行。焦磷酸測序能自動化檢測大量的樣本，近年來發(fā)展迅速。然而分子生物學(xué)技術(shù)均為多學(xué)科技術(shù)融合滲透的成果，必然在某些方面存在不足和一些亟待解決的關(guān)鍵問題，且這些方法都受制于樣本中獲得的DNA質(zhì)量及其PCR效果。但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相信這些問題會得到解決，相關(guān)技術(shù)一定會在腸道微生物的研究中發(fā)揮更加重要的作用。
總之，腸道微生物組研究主要包括微生物組的多樣性和功能活性等兩方面。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的研究方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)是目前主要的兩大研究手段，其中現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)具有快速、高效的特點，尤其是對于不能被培養(yǎng)的微生物的研究具有傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法無法替代的優(yōu)勢。而傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法，可通過培養(yǎng)、分離、鑒定獲得存活的純微生物，進(jìn)而在微生物整體水平上進(jìn)行研究。因此，綜合應(yīng)用各種腸道微生物組的研究方法和技術(shù)才能進(jìn)一步加快對腸道微生物組多樣性及其功能的研究和認(rèn)識。
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