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壁虎醇提物對(duì)小鼠腎包膜下移植S180肉瘤的抑制作用
【摘要】 目的觀察壁虎醇提物對(duì)小鼠腎包膜下移植S180肉瘤的作用并探討機(jī)制。方法建立免疫功能正常小鼠腎囊膜下移植S180肉瘤模型,將40只雄鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照生理鹽水組、陽性對(duì)照環(huán)磷酰胺組(0.1 g·kg-1)、壁虎醇提物高劑量組(2.4 g·kg-1)、壁虎醇提物低劑量組(1.2 g·kg-1)共4組。腹腔注射給藥6 d后,殺鼠稱量荷瘤小鼠體重,評(píng)價(jià)藥物對(duì)小鼠毒性;測量小鼠肉瘤體積,稱取移植瘤小鼠胸腺重、脾臟重,計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù);用SABC免疫組化法檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)。結(jié)果壁虎醇提物可抑制小鼠肉瘤S180生長,環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物高劑量組、壁虎醇提物低劑量組抑瘤率分別為74.5%,77.5%,57.5%,且各組末體重/初體重分別為0.94,1.03,0.99;壁虎醇提物對(duì)免疫器官無影響,而環(huán)磷酰胺組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)與陰性對(duì)照組比則有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);免疫組化顯示環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物組與生理鹽水組比較VEGF蛋白的表達(dá)明顯減少。結(jié)論壁虎醇提物有抗腫瘤活性,其抗腫瘤的部分作用可能通過抑制腫瘤血管的生成而實(shí)現(xiàn) 。
【關(guān)鍵詞】 壁虎醇提物; 血管內(nèi)皮生長因子; 腎包膜; S180肉瘤
壁虎又稱為守宮、天龍等,為壁虎科動(dòng)物無蹼壁虎Gecko swinhoana Gunther或其他幾種壁虎除去內(nèi)臟的全體,是傳統(tǒng)的咸寒軟堅(jiān)中藥,具有祛風(fēng)、定驚、散結(jié)、解毒的功效。大量研究報(bào)道壁虎有顯著的抗腫瘤作用。本課題組前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)中藥壁虎對(duì)食管癌細(xì)胞和S180荷瘤小鼠具有確切的抑制作用[1~3]。但壁虎成分十分復(fù)雜,究竟是何種成分發(fā)揮抗腫瘤作用,目前還不清楚,本課題組從干壁虎中提取得到壁虎醇提物,發(fā)現(xiàn)該醇提物可以抑制小鼠腎包膜下移植S180肉瘤生長。
1 材料與儀器
1.1 壁虎醇提物的制備及試劑加工過程:干無蹼壁虎1 000 g粉碎為粗粉,置于4 000 ml Tris-HCl緩沖液中(pH=7.4),浸泡過夜,超聲細(xì)胞破碎,11 000 r·min-1離心,取上清,加無水乙醇至終濃度為55%,放4℃冰箱中,每20~30 min攪拌1次,4 h后11 000 r·min-1離心,取上清,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇,最終冷凍干燥。環(huán)磷酰胺注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司)。含15%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液。VEGF免疫組化染色試劑盒(福州邁新生物科技開發(fā)有限公司)。
1.2 動(dòng)物及瘤株試驗(yàn)所用昆明種小鼠由河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證:0001350 ),體質(zhì)量(26±3) g,均為雄鼠。S180腹水小鼠由河南省醫(yī)科所提供。
1.3 儀器游標(biāo)卡尺(廣西桂林量具刃具廠);高速冷凍離心機(jī)(江蘇省太倉市華美生化儀器廠);萬分之一電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);冷凍干燥儀(德國MARTIN CHRIST公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司)。
2 方法
2.1 腎包膜下移植S180肉瘤模型建立將S180腹水小鼠抽出腹腔積液離心洗2 次,用無菌生理鹽水液稀釋成1 ×107 個(gè)/ ml的肉瘤細(xì)胞懸液。在小鼠右前腋下接種0. 2 ml肉瘤細(xì)胞懸液。7 d后,殺鼠取瘤。將腋下接種的S180肉瘤標(biāo)本, 于超凈工作臺(tái)剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm 大小之瘤塊, 置于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液中,冰浴存放備用。小鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉,按0.2 ml/100 g動(dòng)物體重麻醉小鼠。小鼠取俯臥位,常規(guī)消毒后從右側(cè)腎臟部位平行脊椎切開一約1 cm 的切口,托出腎臟。以眼科鑷輕提腎囊膜,以自制接種器將S180肉瘤組織小塊接種于腎囊膜下。還納腎臟于體內(nèi),分層縫合肌層及皮膚層。
2.2 壁虎醇提物對(duì)荷瘤小鼠S180移植瘤的抑制作用觀察將40只動(dòng)物隨機(jī)分成4組,生理鹽水對(duì)照組、CTX組、壁虎醇提物高(2. 4 g/kg)、低(1.2 g/kg) 劑量組共4組,每組各10只,根據(jù)體重按0.1 ml/10 g自術(shù)后開始腹腔注射,CTX組第1天注射1次,其余組均1 d/次,給藥6 d后,稱鼠重,處死小鼠,打開腹腔, 以游標(biāo)卡尺測量瘤體長徑(a)與寬徑(b), 計(jì)算瘤體大小(TS),瘤塊生長的△TS值和抑制率:TS= ab2/ 2 △TS= 末體積 - 初體積抑制率( %) = (1- 用藥組瘤體變化/ 對(duì)照組瘤體變化) ×100%
2.3 藥物毒性觀察以小鼠被處死前的體重(FBW) 與給藥前的體重(IBW) 之比值作為判定藥物對(duì)荷瘤小鼠毒性的指標(biāo)。FBW/IBW≥0.80, 則認(rèn)為所測藥物毒性較小。
2.4 壁虎醇提物對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響 按上述方法給藥6 d后,處死動(dòng)物取胸腺,脾臟稱重。胸腺指數(shù)=胸腺重/體質(zhì)量,脾臟指數(shù)=脾臟重/體質(zhì)量。
2.5 小鼠S180肉瘤組織病理學(xué)變化腫瘤組織用10%中性甲醛固定,石蠟包埋切片,常規(guī)HE染色,光鏡觀察肉瘤組織病理變化。
2.6 VEGF蛋白表達(dá)的檢測用SABC免疫組化法,操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。VEGF判定與分析:凡細(xì)胞漿、細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒或均質(zhì)樣棕黃色結(jié)構(gòu)者為VEGF免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞。免疫組化染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是:根據(jù)著色細(xì)胞的比例(染色范圍)及染色強(qiáng)度,染色范圍(陽性細(xì)胞比率)分為0~4級(jí),陰性為0分;陽性細(xì)胞1%~25%為1分;25%~50%為2分;51%~75%為3分;76%~100%為4分。染色強(qiáng)度劃分為0~3級(jí),陰性為0分;弱陽性為1分;中等強(qiáng)度為2分;強(qiáng)陽性為3分;兩者得分相加為最后得分。
2.7 統(tǒng)計(jì)方法運(yùn)用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件,采用單測t檢驗(yàn)。
3 結(jié)果
3.1 壁虎醇提物對(duì)荷瘤小鼠S180移植瘤的抑制作用及毒性反應(yīng)環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物高、低組抑瘤率分別為74.5%,77.5%,57.5%,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),且毒性反應(yīng)小。結(jié)果見表1表1 各組對(duì)小鼠S180肉瘤的抑制作用
3.2 壁虎醇提物對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響 CTX組與對(duì)照組相比,胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)明顯降低(P<0.05),壁虎醇提物各劑量組與對(duì)照組相比無明顯差異,結(jié)果見表2表2 各組對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響 3.3 移植瘤組織病理學(xué)變化經(jīng)HE染色后先在低倍鏡下觀察,然后在高倍鏡下(400×)觀察,陰性對(duì)照組癌細(xì)胞大小和形態(tài)不一致,細(xì)胞染色較深,癌細(xì)胞核體積增大,細(xì)胞核和細(xì)胞漿比例增大,核的大小、形狀、染色不一,核染色深。核染色質(zhì)呈粗顆粒狀,分布不均勻,核仁大,數(shù)目增多,核分裂相增多,可見不對(duì)稱性、多極性及頓挫性等病理性核分裂相,且癌組織間微血管豐富;環(huán)磷酰胺組有大片的細(xì)胞壞死區(qū),壁虎各組均可見不同程度的片狀壞死區(qū),瘤組織內(nèi)及其周圍微血管均減少。
3.4 壁虎對(duì)小鼠移植S180肉瘤組織VEGF蛋白表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示VEGF蛋白在S180肉瘤組織中呈高表達(dá),主要表達(dá)于細(xì)胞的胞漿和包膜,環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物組對(duì)VEGF的表達(dá)有明顯的抑制。結(jié)果見表3及圖1表3 各組小鼠S180肉瘤組織VEGF蛋白表達(dá)
4 討論
從中藥中篩選有效的抗腫瘤藥物已成為國際上發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物的重要途徑,不僅經(jīng)濟(jì),療效可靠,還可以為設(shè)計(jì)更為理想的新藥提供新的化學(xué)結(jié)構(gòu),成為創(chuàng)制新藥的先導(dǎo)化合物。壁虎是中國傳統(tǒng)的中藥材,具有攻毒療瘡、散結(jié)止疼、活血化淤的功效,目前尚未被《中國藥典》收入,壁虎在臨床被廣泛地用于治療多種疾病,對(duì)腫瘤特別是食管癌,胃癌,肝癌等實(shí)體瘤具有獨(dú)特的療效[4,5]。本實(shí)驗(yàn)組提取的壁虎醇提物能顯著的抑制小鼠腎包膜下移植S180肉瘤的生長,壁虎醇提物高、低劑量組抑瘤率可達(dá)到77.5% ,57.5%。研究同時(shí)本研究又對(duì)壁虎高、低劑量組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與對(duì)照組進(jìn)行比較,結(jié)果顯示無明顯差異,而CTX組與對(duì)照組比較下降明顯。并且由FBW/IBW 結(jié)果顯示壁虎醇提物的毒性小。為探討壁虎醇提物抑制腫瘤生長的機(jī)制,我們進(jìn)一步研究其對(duì)血管生成的影響。腫瘤組織內(nèi)血管形成是受機(jī)體內(nèi)促血管生成細(xì)胞因子和抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞因子相互作用的結(jié)果,VEGF是體內(nèi)促進(jìn)血管生成的主要的細(xì)胞因子[6]。在腫瘤的血管生成過程中,VEGF不僅促進(jìn)已經(jīng)存在的血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞的生長,遷移和存活,而且還動(dòng)員骨髓內(nèi)的內(nèi)皮祖細(xì)胞釋放入外周血,抑制VEGF可以降低腫瘤內(nèi)微血管的生成[7,8]。本實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行了VEGF蛋白表達(dá)的檢測,結(jié)果表明與陰性對(duì)照組比,環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物組VEGF蛋白表達(dá)均降低。可見壁虎醇提物抗腫瘤機(jī)制并不是通過增加機(jī)體的免疫力起作用,其機(jī)制可能與降低了VEGF蛋白的表達(dá)有關(guān)。
圖1 各組小鼠S180肉瘤組織VEGF蛋白表達(dá)(400×)
目前對(duì)無蹼壁虎抗腫瘤的活性成分研究較少。研究表明壁虎含有組織胺類、蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素,含維生素C、維生素D、脂肪、粗纖維、胡蘿卜素等[9]。無蹼壁虎抗腫瘤活性成分含有多種物質(zhì),但其抗腫瘤的有效成分究竟是何物,有待結(jié)合藥物化學(xué)進(jìn)行深入研究, 此外是否存在更多的作用靶點(diǎn)也有待于進(jìn)一步深入研究。
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