Megalin基因片段3189-4169的克隆及其表達(dá)

Megalin基因片段（3189-4169）的克隆及其表達(dá)

【關(guān)鍵詞】 腎炎
　　【摘要】 目的 大鼠Heymann腎炎（HN）是人類膜性腎病的經(jīng)典動(dòng)物模型，其發(fā)病機(jī)制的研究推動(dòng)了人們對膜性腎病的理解。Megalin是HN主要致病抗原，也是低密度脂蛋白受體家族成員，其胞外結(jié)構(gòu)形成的4簇配體結(jié)合區(qū)域均可能存在抗原決定簇。本實(shí)驗(yàn)擬克隆其第2簇配體結(jié)合區(qū)域，并表達(dá)融合蛋白，為進(jìn)一步研究其抗原決定簇的確切位置及其功能打下基礎(chǔ)。方法 采用RT-PCR獲得大鼠腎目的片段Megalin基因3189-4169，再與原核表達(dá)質(zhì)粒pTrcHis A結(jié)合構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入TOP10細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，最后用Western-Blot檢測表達(dá)的融合蛋白。結(jié)果 （1）RT-PCR獲得的目的片段大小為1kb，測序證實(shí)為Megalin基因3189-4169;測序報(bào)告還顯示有3個(gè)突變，分別位于Megalin基因的3404、3647、3702，其中前兩個(gè)突變都不影響融合蛋白的氨基酸序列，第3個(gè)突變則將賴氨酸變成谷氨酸，經(jīng)分析對融合蛋白表達(dá)無明顯影響。（2）構(gòu)建的重組質(zhì)粒用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，得到預(yù)期的2個(gè)片段4.4kb和1kb，分別表示質(zhì)粒pTrcHis A和Megalin基因3189-4169。（3）用IPTG誘導(dǎo)TOP10（含有重組質(zhì)粒）融合蛋白表達(dá)后，經(jīng)Western-Blot檢測發(fā)現(xiàn)了38kD的目的蛋白。陽性對照TOP/CAT在IPTG誘導(dǎo)前沒有出現(xiàn)蛋白條帶，在IPTG誘導(dǎo)后4h出現(xiàn)蛋白條帶；陰性對照TOP10（不含有質(zhì)粒）和TOP10（含有pTrcHis A）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后均無目的條帶出現(xiàn)。另外，融合蛋白的表達(dá)量在IPTG誘導(dǎo)后4~6h增加明顯。結(jié)論 成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒（帶有Megalin基因3189-4169的pTrcHis A）；成功誘導(dǎo)了融合蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步研究Megalin基因抗原決定簇的確切位置及研究Megalin的功能提供了基礎(chǔ)。

　　【關(guān)鍵詞】 腎炎;基因;表位;融合蛋白
　　【Abstract】 Objective Rat Heymann nephritis（HN）is a classic model of human membranous nephropathy.Research of its pathogenesis help understand the human membranous nephropathy.Megalin is the major antigen of HN,and it is also a member of the low density lipoprotein receptor gene family；its extracellular region can bind multiple ligands,and this extracellular region form four clusters of ligand-binding domains containing pathogenic epitopes.So we cloned the second cluster of ligand binding repeats and express the recombinant proteins containing N-Terminal 6xHis tags.This study was aimed to provide the basis to precisely locate the pathogenic epitope and help understand its function.Methods We applied reverse transcription PCR to obtain objective band（Megalin gene 3189-4169）,then constructed the recombinant plasmid by inserting this fragment into pTrcHis A.After the recombinant plasmid was transfected into TOP10,the expression of 6xHis fusion protein was induced by isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）.Finally Western-Blot was performed to detect the fusion protein.Results RT-PCR showed the size of object band wss 1kb.After recombinant plasmid were digested with BamHⅠand EcoRⅠ,we obtained two fragments:one size was 1kb,the other was 4.4kb.Western-Blot showed the fusion protein size was 38kD，and the yield of fusion protein was obviously increased at 4~6 hours by IPTG inducing.Conclusion We succeed in constructing recombinant plasmid and obtaining the fusion protein,which may provide basis for further study.
　　【Key words】 nephritis;gene;epitope;fusion protein
　　膜性腎病是兒童及成人常見難治性腎臟疾病之一，以上皮下免疫復(fù)合物的沉積致腎小球基底膜增厚和蛋白尿?yàn)樘卣�；其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)有對膜性腎病的認(rèn)識(shí)很多來自于其經(jīng)典動(dòng)物模型Heymann腎炎（HN）的研究。因此，對Heymann腎炎的分子免疫病理機(jī)制的研究將有助于提高對膜性腎病的認(rèn)識(shí)，從而改進(jìn)治療。
　　現(xiàn)已明確Megalin（也稱gp 330）是HN的主要致病抗原成分，在腎臟主要表達(dá)于近端小管的刷狀緣和腎小球上皮細(xì)胞的胞被小凹中［1,2］。它是一個(gè)跨膜糖蛋白，屬于低密度脂蛋白受體家族成員，胞外區(qū)形成4簇潛在的受體配體結(jié)合區(qū)域［3］；可與多種配體結(jié)合，包括受體相關(guān)蛋白（RAP）、血纖維蛋白溶酶原、細(xì)胞外基質(zhì)成分、纖溶酶原激活因子和纖溶酶原激活因子抑制物Ⅰ型復(fù)合物、載脂蛋白E富集的β-VLDL、脂蛋白脂肪酶、乳鐵轉(zhuǎn)移蛋白以及鈣離子、胰島素等［4~7］。對Heymann腎炎中Megalin可能與RAP結(jié)合形成HN抗原復(fù)合物，再與循環(huán)中的抗體結(jié)合形成原位免疫復(fù)合物，導(dǎo)致腎小球的損傷和繼之的大量蛋白尿［4,8］。

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