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柴胡疏肝散抗肝纖維化的實驗研究
作者：付德才 楊世忠 宋祥福【摘要】 目的 探討柴胡疏肝散對肝纖維化大鼠模型α?SMA、TGF?β1的影響及其抗纖維化的機制。方法 采用40% CCl4皮下注射，制備肝纖維化模型并以柴胡疏肝散干預，測定肝功能、血清透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)及肝組織羥脯氨酸(HYP)，光鏡觀察肝組織病理變化，免疫組織化學法檢測肝組織α?SMA、TGF?β1表達，RT?PCR 檢測TGF?β1 mRNA 的表達。結果 柴胡疏肝散組較模型組:肝功能明顯改善，血清HA及LN顯著降低，肝組織HYP含量明顯少，肝組織纖維化程度明顯改善，肝組織α?SMA及TGF?β1表達減少。結論 柴胡疏肝散對CCl4 誘導的大鼠肝纖維化有良好的防治作用。
【關鍵詞】 柴胡疏肝散；肝纖維化；α?SMA；TGFβ1
近年來柴胡疏肝散抗肝纖維化的臨床研究取得了較好的臨床效果〔1〕，但目前國內外尚無柴胡疏肝散抗肝纖維化的基礎研究。本實驗采用四氯化碳(CCl4)大鼠肝纖維化模型,觀察柴胡疏肝散的抗肝纖維化作用,并探討其對α?平滑肌肌動蛋白(α?SMA)、轉化生長因子(TGF?β1)影響及柴胡疏肝散抗肝纖維化的理論機制。
1 材料與方法
1?1 材料
1?1?1 動物及藥物 雄性22月齡Wistar 大鼠60 只,體重300～350 g，由吉林大學實驗動物中心提供。柴胡疏肝散(柴胡6 g，陳皮6 g，川芎5 g，香附5 g，枳殼5 g，赤芍5 g，甘草3 g，由長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院提供) 經冷水浸泡藥材2 h，常規(guī)兩煎,頭煎1?5 h，二煎1 h，兩次水煎液混合并過濾,經水浴蒸發(fā)濃縮成含生藥1?12 g/ml的濃縮藥液冷藏備用。按體表面積折算,大鼠每天的柴胡疏肝散等效劑量為2?8 g/kg(體重) 。
1?1?2 藥品及試劑 CCl4購自北京北化精細化學品有限責任公司)；秋水仙堿(colchicine) 購自昆明股份制藥有限公司;谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶試劑盒購自上�？菩郎锛夹g研究所；血清總膽紅素(TBIL)試劑盒購自上�？迫A東菱診斷用品有限公司；透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)放射免疫分析測定盒購自上海海軍醫(yī)學研究所生物技術中心；單克隆急用型鼠抗人生α?SMA試劑盒購自北京中杉生物公司，兔抗大鼠TGF?β1多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，即用型SP免疫組化試劑盒購自福州邁新試劑公司，DAB購自北京中山生物公司，RT?PCR兩步法試劑盒購自TAKARA公司，Trizol購自Sangon公司。
1?2 方法
1?2?1 模型制作 參照文獻〔2〕方法：實驗第1 天除正�？瞻讓φ战M(對照組) 外,其余動物皮下注射CCl4 分析純0?5 ml/100 g (體重),以后每隔3 d注射40% CCl4 橄欖油劑0?3 ml/100 g(體重),連續(xù)8 w。實驗前2 w飼喂高脂玉米粉飼料(79?5%玉米粉 20%豬油 0?5%膽固醇)，第3～6周飼喂100%玉米粉和30%乙醇飲料。
1?2?2 分組及給藥方法 將60 只大鼠隨機分為4組,每組15只，第1組對照組,飼喂正常飲食;第2組模型組,按上述造模方法給予飲食;第3組柴胡疏肝散治療組,于造模3 w開始,給予柴胡疏肝散煎劑灌胃,每日2?8 g/kg;第4組秋水仙堿組，于造模3 w開始給予秋水仙堿0?1 mg/(kg·d)-1，共8 w。
1?2?3 標本制作 上述造模及處理過程結束日，禁食12 h后稱質量，股靜脈取血，分離血清置-20℃保存;并立刻完整摘取肝臟及脾臟，稱質量后用生理鹽水漂洗肝左葉數(shù)次，濾紙拭干后，切取0?2 g置于冰浴中的組織勻漿器內，加入冰生理鹽水2 ml，制備成100 g/L肝組織勻漿，4 000 r/min 4℃離心，取上清液保存于-20℃。肝右葉置于40 g/L中性甲醛液中常規(guī)固定后，石蠟包埋，用于制作組織芯片。
1?3 檢測指標
1?3?1 血清及組織纖維化指標檢測 測定血清肝功能包括總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、A/G，檢測透明質酸(HA)，Ⅲ型前膠原(PCⅢ)，N型膠原(CN)，層黏蛋白(LN)含量(放射免疫分析法):肝勻漿檢測羥脯氨酸(HYP)含量(二甲氨基苯甲醛法)，檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，均按試劑盒說明書操作。
1?3?2 病理檢測 組織芯片分別行常規(guī)HE染色，Masson三色染色(染膠原纖維)及網(wǎng)織纖維染色，光鏡下觀察，并根據(jù)王泰齡等改進的肝纖維化半定量評分系統(tǒng)(SSS)〔3〕進行炎癥活動度及肝纖維化程度計分。
1?3?3 免疫組織化學檢查α?SMA、TGF?β1 采用石蠟包埋常規(guī)切片,SP法,兔抗鼠TGF?β1,多克隆抗體及鼠抗鼠α?SMA單克隆抗體均以1∶100 稀釋,DAB 顯色,蘇木素復染。PBS 代替一抗作為陰性對照。陽性組織呈棕色，陰性組織呈藍色?在全自動圖像分析系統(tǒng)上，采用HPIAS?2000型圖像分析軟件進行定量分析，隨機選取每張切片10個視野(×400)倍測定陽性細胞的A值與所占視野面積，取其乘積平均值為該組織切片所得值，兩項乘積越大表明組織中該抗原含量越高。
1?3?4 RT?PCR檢測 大鼠GAPDH 上游引物:5′?CATGACCACAGTCCATGCCATC?3′,下游引物：5′?CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC?3′全長450 bp；TGFβ1 上游引物：5′?TGAGTGGCTGTCTTTTGACG?3′，下游引物：5′?ACTTCCAACCCAGGTCCTTC?3′全長350 bp。α?SMA上游引物：5′?AAGAGGAAGACAGCACAGCTC?3′,下游引物：5′?GATGGATGGGAAAACAGCC?3′稱取50～100 mg 肝組織用Trizol 提取總RNA，采用分光光度法測定其含量及純度，測定A260/A280 值。取2 μg 總RNA，42 ℃逆轉錄90 min。參數(shù)設置94 ℃變性,3 min ×1 循環(huán)。94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環(huán)。最后72 ℃徹底延伸7 min ×1 循環(huán)。同法擴增GAPDH 作為內參照。取5 μl PCR 產物1?5%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測灰度,TGF?β1/GAPDH 比值表示TGF?β1 mRNA 相對水平。α?SMA/GAPDH 比值表示α?SMAmR2NA 相對水平。
1?4 統(tǒng)計學分析 實驗結果計量數(shù)據(jù)以x±s表示，經SPSS11?10軟件包進行方差分析，組間比較采用t檢驗。
2 結果
2?1
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