外周血PSA、PSA mRNA聯(lián)合檢測(cè)在前列腺癌診斷中的臨床應(yīng)用

外周血PSA、PSA mRNA聯(lián)合檢測(cè)在前列腺癌診斷中的臨床應(yīng)用

作者：辛華　馬雷　高英英 郭宇航　孫玉鴻　江清林　劉國(guó)輝
【摘要】 目的 探討利用外周血PSA、PSA mRNA聯(lián)合檢測(cè)診斷前列腺癌（PCa）的臨床應(yīng)用及意義。方法 運(yùn)用酶聯(lián)免疫分析和巢式RT?PCR檢測(cè)22例PCa、10例良性前列腺增生（BPH）患者，5例健康男性和5例健康女性外周血中PSA、PSA mRNA的情況。結(jié)果　PCa患者血清PSA的水平與臨床分期、Gleason評(píng)分有關(guān)（P＜0?05），而與年齡無(wú)關(guān)（P＞0?05）；外周血PSA、PSA mRNA與臨床分期、內(nèi)分泌治療有關(guān)（P＜0?05），而與年齡、Gleason評(píng)分無(wú)關(guān)（P＜0?05）；22例PCa標(biāo)本中PSA mRNA陽(yáng)性表達(dá)15例，陽(yáng)性率68%，10例BPH和10例陰性對(duì)照標(biāo)本無(wú)表達(dá)。結(jié)論 利用外周血PSA、PSA mRNA聯(lián)合檢測(cè)是一種早期發(fā)現(xiàn)PCa微轉(zhuǎn)移，判斷其臨床變化過(guò)程、分期、預(yù)計(jì)復(fù)發(fā)和評(píng)價(jià)療效的方法。
【關(guān)鍵詞】 前列腺特異抗原；前列腺癌；前列腺增生；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
　　臨床上大約有50%的前列腺癌(PCa)病人在確診時(shí)就已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移,病變已屬晚期，預(yù)后不良〔1～3〕。國(guó)外報(bào)道血清游離PSA與外周血PSA mRNA聯(lián)合檢測(cè)PCa在鑒別良、惡疾病上有一定優(yōu)越性〔4，5〕。國(guó)內(nèi)這方面報(bào)道較少。應(yīng)用RT?PCR技術(shù)檢測(cè)外周血中存在的少量癌細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移，對(duì)腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后及臨床治療具有指導(dǎo)意義〔6，7〕。本研究采用酶聯(lián)免疫技術(shù)和巢式RT?PCR技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)外周血PSA和PSA mRNA，以提高PCa微轉(zhuǎn)移的診斷效率、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)、預(yù)測(cè)腫瘤分期及預(yù)后。
　　1 材料與方法
　　1?1 病例資料
　　PCa組：選擇2005～2006年佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院、佳木斯市中心醫(yī)院門(mén)診和住院病人。22例均為初診PCa患者，均經(jīng)前列腺穿刺病理診斷，年齡64～82歲，平均72歲。22例PCa患者中有15例接受了內(nèi)分泌治療，7例未接受。BPH組：10例均為行前列腺經(jīng)尿道電切術(shù)后病理證實(shí)患者，年齡34～81歲，平均65歲。陰性對(duì)照組：5例男性健康志愿者（檢測(cè)前1個(gè)月限制性生活）和5例女性健康志愿者，血液學(xué)指標(biāo)均正常，年齡25～45歲，平均38歲。
　　1?2 儀器及材料

　　Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所，總RNA提取RNAiso試劑盒、兩步法RT?PCR試劑盒購(gòu)自大連生物工程有限公司，引物由上海生物工程服務(wù)技術(shù)有限公司合成，PSA定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)博檢生物試劑有限公司。Biometra Tg PCR 儀：華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司；DU800核酸蛋白分析儀：Beckman公司；免疫分析儀器：DNM9602G型酶標(biāo)分析儀（北京普朗儀器公司）。
　　1?3 引物序列

　　PCR引物：（1）外引物：PSA?494：5’?TACCCACTGCATCAGGAACA?3’；PSA?960：5’?CCTTGAAGCACACCATTACA?3’。（2）內(nèi)引物：PSA?559：5’?ACACAGGCCAGGTATTTCAG?3’；PSA?894：5’?GTCCAGCGTCCAGCACACAG?3’。β?actin 上游：5’?CGGGAAATCGTGCGTGACAT?3’；下游：5’?GAACTTTGGGGGATGCTCGC?3’。擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為712 bp。
　　1?4 血清的提取

　　抽取空腹靜脈血（各項(xiàng)檢查前）5 ml，立即2 000 r/min離心10 min，分離血清置-20℃保存，1 w內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。
　　1?5 外周血單個(gè)核細(xì)胞的提取
　　抽取5 ml靜脈血（各項(xiàng)檢查前）肝素抗凝，用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞置-80℃冰箱保存，提取過(guò)程按其說(shuō)明書(shū)操作。
　　1?6 總RNA的抽提及質(zhì)量鑒定
　　用Trizal試劑提取總RNA，提取過(guò)程按其說(shuō)明書(shū)操作。提取產(chǎn)物用1?2%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。紫外分光光度計(jì)下測(cè)OD260、OD280，測(cè)定RNA純度和濃度。取OD260/OD280值在1?8～2?0范圍內(nèi)的標(biāo)本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。所有實(shí)驗(yàn)中的塑料制品及實(shí)驗(yàn)用具均經(jīng)0?1轕C水處理后高壓滅菌。
　　1?7 RT?PCR
　　取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl和PSA上下游外、內(nèi)引物各1 μl，使用20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行2次PCR（2次PCR反應(yīng)體系相同），同時(shí)擴(kuò)增PSA、β?actin和陰性對(duì)照cDNA（由健康女性外周血白細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得）。具體循環(huán)參數(shù)為：94℃ 4 min，94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s；25個(gè)循環(huán)之后，72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用EB染色，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照。
　　1?8 血清PSA的檢測(cè)
　　PSA定量檢測(cè)由專(zhuān)人嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
　　1?9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　應(yīng)用SPSS10?0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。
　　2 結(jié)果
　　2?1 PCa組、BPH組、陰性對(duì)照組血清PSA檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。表1 PCa組、BPH組、陰性對(duì)照組血清PSA的檢測(cè)結(jié)果（略）
　　2?2 PCa組血清PSA檢測(cè)結(jié)果與臨床參數(shù)的關(guān)系
　　見(jiàn)表2。表2 PCa組血清PSA與

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