柳茶多糖的分離純化及氣相色譜-質(zhì)譜分析
目的探索川麥冬須根普通粉和超細(xì)微粉間表面特性和溶出性的差異，以便更好地利用川麥冬須根資源。方法通過普通光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡對(duì)普通粉和超細(xì)微粉的形態(tài)學(xué)觀察，通過對(duì)粒徑、分布寬度、比表面積、松密度、壓縮度及其浸出物測(cè)定等方法對(duì)其普通粉和超細(xì)微粉進(jìn)行比較分析。下面是小編搜集整理的相關(guān)內(nèi)容的論文，歡迎大家閱讀參考。
【摘要】 目的首次提取柳茶中的水溶性粗多糖并進(jìn)行分離、純化及組成分析。方法柳茶經(jīng)熱水提取、乙醇沉淀、Sevag法去蛋白、H2O2脫色，逆向流水透析得多糖精制品。將精多糖衍生化后運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析。結(jié)果確定了柳茶中水溶性多糖分別由核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其中以核糖、葡糖糖、半乳糖為主。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、靈敏，可以準(zhǔn)確測(cè)定出柳茶多糖中所含有的各種單糖。
【關(guān)鍵詞】 柳茶多糖; 純化; 氣相色譜-質(zhì)譜; 單糖
柳茶為藏族民間常用藥，以薔薇科(Rosaceae)鮮卑花屬(Sibiraea)植物窄葉鮮卑花Sibiraea angustata (Rehd.) Hand-Mazz. 和鮮卑花Sibiraea laecigata (L) Maxim.的枝葉及果序(帶果實(shí)的果枝)入藥，主要用于消食導(dǎo)滯、疏散風(fēng)熱;據(jù)藏藥文獻(xiàn)記載，柳茶主治熱病和疫病[1]�，F(xiàn)藏族民間常作茶飲，治療食后腹脹等諸多原因引起的消化不良，每每見效。柳茶中除含有揮發(fā)油、微量元素外，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)還含有豐富的多糖。多糖作為提高機(jī)體免疫功能的保健品已被許多人接受，但許多多糖產(chǎn)品僅僅停留在保健品階段，未能開發(fā)成藥物，主要原因是多糖的分離純化困難，技術(shù)不過關(guān)。因此本文旨在對(duì)柳茶多糖的提取、純化、組分分析進(jìn)行研究并對(duì)其營(yíng)養(yǎng)保健功能進(jìn)行探討，以期為柳茶的開發(fā)及其綜合利用提供參考。
一、儀器與材料
1.1 儀器 UV-2450紫外分光光度計(jì)(日本島津) ; NE2155電子天平(德國(guó)賽多利斯儀器公司);Agilent 5793I-6890氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS);SE-54彈性石英毛細(xì)管柱(50 m×0.25 mm id×0.50 μm);高純氦(純度≥99.999%);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦瀘西儀器廠)。
1.2 材料 鮮卑花屬植物葉采自甘肅省甘南藏族自治州合作市郊，海拔3 200 m以上。經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)研究所楊永建教授鑒定其為薔薇科(Rosaceae)鮮卑花屬(Sibiraea)植物窄葉鮮卑花Sibiraea angustata (Rehd.) Hand-Mazz. 和鮮卑花Sibiraea laecigata (L) Maxim.的葉。
單糖標(biāo)準(zhǔn)品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品 (Fluka公司)，鹽酸羥胺、吡啶、三氟乙酸、乙酸酐、氯仿以及其他試劑等均為國(guó)產(chǎn)分析純，蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。
二、方法
2.1 多糖的提取與純化
2.1.1 粗多糖的提取取一定量的柳茶依次用石油醚、乙醚除去脂溶性雜質(zhì)。加10倍量的水90～100℃提取3次，3 h/次，合并水提液，過濾。70℃水浴減壓濃縮至適量，加入5倍量95 %的乙醇純析，靜置過夜，離心過濾，置真空冷凍干燥得柳茶多糖粗品。
2.1.2 粗多糖純化[2]將多糖粗品溶于蒸餾水，去不溶物，按Sevag法(氯仿∶正丁醇=4∶1)脫蛋白，重復(fù)10次以上，然后移至透析袋中用去離子水逆流透析24 h，直至紫外光譜分析檢測(cè)無蛋白吸收。以氨水調(diào)節(jié)pH為8，滴加H2O2，50℃保溫脫色2 h，減壓濃縮，加入5倍量的無水乙醇，靜置過夜，離心收集沉淀，將沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚漂洗2次，冷凍干燥得去蛋白多糖純品。
2.1.3 紫外光譜分析 取柳茶多糖適量，加水溶解，配制成濃度為1.0 g/L的多糖水溶液，采用紫外可見分光光度法190～700 nm范圍內(nèi)掃描。光譜顯示柳茶多糖具有多糖特征性的'紫外吸收?qǐng)D譜僅在200 nm處有一銳細(xì)吸收峰，大于250 nm無明顯的紫外吸收，是平坦的背景。結(jié)果表明，提取純化的多糖中不含有核酸、蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)成分。
2.2 柳茶多糖的氣相色譜質(zhì)譜測(cè)定
2.2.1 供試品溶液(糖腈乙酰酯衍生物)的制備稱取20 mg柳茶純化多糖樣品溶于2 ml 2 mo1/L的TFA中，封管，于100℃水解6 h，減壓除盡TFA。在水解產(chǎn)物中加入20 mg鹽酸羥胺和1 ml吡啶，封管于90℃反應(yīng)30 min。冷至室溫，再加入1 ml乙酸酐，封管于90℃反應(yīng)30 min，冷卻后轉(zhuǎn)出上層清液，減壓濃縮至干。滴入0.5 ml氯仿溶解后進(jìn)行氣相色譜——質(zhì)譜分析。
2.2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取單糖標(biāo)準(zhǔn)品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖對(duì)照品20 mg，采用上述方法制備乙�；苌铮确氯芙夂筮M(jìn)行氣相色譜—質(zhì)譜分析。
2.3 GC-MS分析條件
2.3.1 色譜條件SE-54毛細(xì)管柱，氣化室溫度270℃，柱前壓17.8 kPa，分流比30∶1，采用恒流模式載氣He流量1.2 ml/min，進(jìn)樣量1 μl，程序升溫：起始溫度100℃保持6 min，以20℃/ min 升至220℃保持14 min，以5℃/ min 升至290℃。
2.3.2 質(zhì)譜條件電子轟擊源(EI)，電子能量70 eV ;離子源溫度：230℃;四極桿溫度：150℃;傳輸桿溫度：280℃;掃描范圍：14～400 amu。
三、結(jié)果
3.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品和柳茶多糖的GC—MS分析
3.1.1 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品乙�；苌锏目傠x子流圖見圖1。根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品的乙�；苌锏腉C-MS的總離子流圖，確定7種混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的GC一MS總離子流圖的出峰順序?yàn)楣�、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖�?/p>
3.1.2 柳茶多糖的乙酰化衍生物的總離子流圖見圖2。根據(jù)柳茶多糖的總離子流圖，通過各峰的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜尼斯特譜庫(NIST)對(duì)照分析可以確定其含有核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，出峰時(shí)間及其組成含量見表1。
四、 討論
分析多糖中單糖組成，首要的工作就是將多糖樣品進(jìn)行徹底的水解。因?yàn)槿绻庑Ч焕硐�，多糖很難完全水解為單糖或者僅僅有很少部分水解，導(dǎo)致樣品水解衍生化產(chǎn)物在氣相色譜分析中峰值很小，從而影響多糖中含量較少的單糖測(cè)定。通過對(duì)影響水解效果的各種因素的綜合考察分析，得出對(duì)于柳茶多糖的水解應(yīng)采用2 ml 2mo1/L的TFA水解6 h較為合適。在此水解條件下，可以使多糖較為完全地水解。而硫酸也可用于多糖的水解，但實(shí)驗(yàn)時(shí)采用低濃度的硫酸水解時(shí)效果不理想，高濃度的硫酸則易造成多糖的碳化。且由于硫酸沸點(diǎn)比較高，水解后殘留的酸不容易揮發(fā)除去，必須用碳酸鋇中和處理，容易造成樣品組分的損失。
柳茶多糖中的單糖含量
柳茶多糖在空氣中提取或干燥時(shí)顏色會(huì)加深，可用過氧化氫或活性炭脫色，活性炭在脫色時(shí)使用量大，樣品損失較多，故采用H2O2脫色。在用過氧化氫脫色處理后，一定要透析至無過氧化氫檢出，H2O2檢出用高錳酸鉀法。此外，在醇洗及醚洗、抽濾時(shí)用薄膜蓋住樣品，可減少空氣接觸，防止顏色加深。在脫色時(shí)50℃保溫脫色2 h，時(shí)間短色素太多影響檢測(cè)結(jié)果，時(shí)間長(zhǎng)也沒有更好的脫色效果。
柳茶中除含有揮發(fā)油、微量元素、三萜類化合物等多種化學(xué)成分外，課題組發(fā)現(xiàn)其所含多糖也是其主要活性成分之一;多糖作為藥物應(yīng)用是在20世紀(jì)40年代，自20世紀(jì)60年代以來，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多糖具有更多的生物活性。不僅具有免疫調(diào)節(jié)功能，還可以抗感染、降血糖和抗腫瘤等，隨著多糖類化合物研究的深入，其在抗腫瘤和病毒的臨床治療方面顯示了廣闊的應(yīng)用前景。本文首次對(duì)柳茶多糖的化學(xué)組成進(jìn)行研究，對(duì)開發(fā)利用本地資源有一定的意義。對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究，將有利于闡明其活性與成分的關(guān)系。
【參考文獻(xiàn)】
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