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生命科學圖像采集系統論文
1共焦顯微原理與系統方案
基于針孔式掃描盤建立的快速共焦顯微系統的結構如圖1所示，激發光源發出的光經過準直、擴束之后，透過分光鏡，依次經過快速掃描盤和顯微物鏡。物鏡匯聚的激發光照射在樣品上，樣品受激發射的熒光按照原光路返回，當發射熒光經過快速掃描系統時，被濾去物方非焦面發射的雜散光。分光鏡反射的熒光經過透鏡匯聚后被CCD接收，獲取樣品共焦顯微圖像。通過控制樣品在Z軸上步進，進而改變樣品的光切位置，可以獲得樣品不同切面的圖像，最終通過一定的圖像處理技術可以獲得樣品的三維圖像。
2EMCCD相機結構與組件內容
圖1所建立的共焦顯微系統以針孔盤作為掃描部件，它以多點針孔同時對視場進行掃描，因此，圖像采集器件宜采用面陣器件，綜合探測靈敏度、圖像輸出幀頻、空間應用等角度考慮，系統采用EMCCD作為圖像采集器件。它與傳統CCD器件在感光、存儲等結構上并無差異，之所以在探測靈敏度、信噪比上表現出色，是因為在其讀出寄存器之后又多出了一串增益寄存器，增益寄存器的單個倍增單元如圖2所示。與普通的三相CCD轉移電極相比，EMCCD將Ф2分為Ф2和Фdc，一般Фdc接2V左右的直流偏置，Ф2接高壓(40V左右)轉移時鐘，由于Ф2與Фdc之間存在高壓差，當信號電荷從Ф1向Ф2轉移時，強電場會使電荷加速并與其他電荷碰撞產生新的電子，電子被Ф2勢井收集實現1次信號倍增。單個倍增單元的倍增率是隨機的，一般在1%～1．5%范圍內，雖然單個倍增單元增益很低，但當多個倍增單元級聯時，總增益由式(1)確定G=(1+g)n．(1)其中，g為單個倍增單元的倍增率，n為倍增單元數，當n取500時，總增益可能達2000倍以上。系統采用英國E2V公司的CCD97器件作為成像探測器［3］，CCD97是減薄背照式幀轉移型EMCCD，具有512×512有效像素，像素尺寸為16μm×16μm，它同時具有普通模式與倍增模式成像方式，相應具有兩路讀出放大器。倍增模式下制冷到－40℃，可達30photons/pixel/s(積分時間為0．1s)的探測能力，滿足弱光探測需求，同時在11MHz像素時鐘下，噪聲低于1電子/pixel，量子效率達90%以上，滿足高幀頻需求。整套系統的電子學設計圍繞EMCCD的驅動需求展開，按功能主要劃分為3個模塊:邏輯驅動模塊、功率驅動模塊和上位機圖像采集模塊，系統功能框圖如圖3所示。
2．1邏輯驅動模塊
邏輯驅動模塊主要完成EMCCD幀轉移、行轉移、行輸出等邏輯信號輸出、AD時序控制輸出、SＲAM時序控制輸出以及圖像數據串行輸出等功能，邏輯模塊核心器件采用ACTEL公司的APA300器件，它基于Flash技術，無需配置芯片，功耗低，對固件錯誤有較好的免疫作用，可以抵御一些高能粒子的沖擊，最大優勢在于在特殊環境下可以穩定可靠地工作，適合航天領域的應用。圖像信號采集部分用AD9824，它是ADI公司一種專用于CCD信號處理的AD器件，它包含14位精度最高采樣率為30MSPS的A/D轉換器，芯片內部集成了相關雙采樣電路、像素增益放大器、可編程增益放大器。邏輯驅動模塊的硬件程序各子模塊的調用關系如圖4所示。
2．2功率驅動模塊
CCD97的驅動除了對信號相位要求嚴格外，還要求信號電平和上升時間多樣化，針對不同信號的電平和上升時間需求，功率驅動模塊采用4種電路方案，包括偏置電平電路、圖像轉移信號電路(ФIS，ФＲ)及高壓時鐘電路。由于CCD97直流偏置所需電流不大，所以，偏置電平電路采用電阻分壓與運放跟隨實現。圖像轉移信號上升時間較短，需要較大的驅動電流，圖像幀轉移、行轉移、行輸出信號功率驅動電路以EL7457作為核心器件。它是Elantec公司推出的四通道CMOS專用驅動器，最高工作頻率可達40MHz，最大驅動電流2A，具有低輸出阻抗、外圍電路簡單、方便電源管理等優點，非常適用于多電平復雜時序的CCD器件驅動設計。圖像轉移信號功率驅動電路如圖5所示［4］，由于ФI，s，ФＲ信號的上升時間要求不同，實際調試電路時選擇合適的電阻器(Ｒ1～Ｒ5)使得信號上升時間盡量滿足器件需求，保證輸出的圖像質量較高。高壓時鐘是實現倍增模式成像的關鍵信號，它的電平決定了倍增增益，并最終影響器件在低照度下的成像效果。由于高壓時鐘的電平較高，一般在40V左右，驅動電流100mA左右，使用集成元件很難實現，所以，高壓時鐘電路采用分立元件實現，電路如圖6所示［5］。圖中電路的靜態偏置由二極管D1，D2，D3，D4，D5，D6以及電阻器Ｒ1，Ｒ3，Ｒ4所組成的分壓網絡提供。Q1的柵源極靜態電壓約為－1V，Q2的柵源極靜態電壓約為1V。當FPGA驅動脈沖為低時，U1和U2的輸出為5V，Q1的柵源極電壓為－1V，Q2的柵源極電壓為6V，此時，Q1關斷，Q2導通，2HV被拉低到0V;當FPGA脈沖為高時，U1和U2的輸出為0V，Q1的Vgs為－6V，Q2的Vgs為1V，此時Q2關斷，Q1導通，Ф2HV被拉高到電源電壓Vhigh。Ф2HV的輸出相位與FPGA輸出邏輯信號相同，高低電平與高壓電源一致。
2．3上位機軟件
上位機控制軟件主要負責指令編碼、指令下傳以及圖像數據接收、圖像數據存儲、圖像顯示等工作。上位機軟件開發環境為VC++6．0，通過調用操作系統自帶的MScomm控件完成指令下傳與數據接收。通過點擊界面上的“打開串口”按鈕建立相機與上位機間的通信，點擊“打開相機”按鈕完成相機參數與開機指令下傳，開啟圖像數據接收線程，待正確接收數據包頭并完成一整幅圖像數據接收后，顯示接收圖像并保存圖像數據。
3圖像采集驗證與分析
驗證實驗鏡頭采用MV2514機器視覺鏡頭，該鏡頭放大倍率為0．23倍，焦距為25mm，F數可小至1．4，可見光波段內透過率約90%，機械接口為標準C接口，可兼容2/3inCCD，最小工作距130mm。實驗中采用6mm特寫環在0．01lx微光、100ms積分時間、2dB增益條件下使用普通模式與倍增模式分別對同一目標成像，圖像如圖7所示。從獲得的暗背景條件下的圖像數據可計算出噪聲平均灰度值與方差，分別選擇普通模式下與倍增模式下目標圖像的最亮點作為信號，取多幅圖像數據的亮點信號并計算平均值，可以獲得普通模式下與倍增模式下的信噪比，列于從表中可以得出:相比普通模式，在44V倍增時鐘電壓驅動下，倍增模式輸出圖像的信號有7倍提升，信噪比也有8倍提升，證明CCD97在微弱光條件下，使用倍增模式可以獲得較高質量的目標圖像。根據圖1搭建共焦顯微系統，使用40倍物鏡對擬南芥進行熒光顯微成像。普通顯微模式與共焦顯微模式分別對樣品所成圖像如圖8所示。EMCCD相機倍增模式與普通模式使用相同AD增益，積分時間分別取100，50ms。從圖8可以看出:EMCCD在倍增模式下可以獲得比較清晰的擬南芥葉肉共焦顯微熒光圖像。相比普通顯微模式，由于對樣品進行光切的原因，使得系統在共焦顯微模式下可以清晰的分辨出擬南芥葉肉葉綠體。
4結論
通過對空間生命科學實驗中共焦顯微的原理分析，提出一套適用于活體目標觀察、對樣品低損傷的共焦顯微方案。根據目標的掃描方案和獲取目標發射光的能量大小提出基于CCD97的弱光圖像采集系統，將系統分成3個功能模塊分別實現并最終完成原理樣機研制。在普通模式與倍增模式下分別獲取目標圖像，從圖像效果可以看出:該成像系統性能較高，對弱光目標有很好的成像效果，且該系統具有體積小、可靠性高、適合空間應用等特性。
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