血小板凍干再水化的條件及其凝血功能變化
血小板數(shù)目減少或功能不全所致出血性疾患的預(yù)防和治療，下面是小編搜集的一篇關(guān)于血小板凍干再水化條件探究的論文范文，歡迎閱讀查看。
血小板(platelet)是由骨髓巨核細(xì)胞產(chǎn)生并釋放于血液循環(huán)中的最小細(xì)胞,在止血和凝血過程中發(fā)揮著重要的作用。 由于血小板保質(zhì)期較短，臨床輸注需求量大， 加之臨床輸注需求時(shí)間的不確定性， 造成了血小板過期浪費(fèi)和臨床供不應(yīng)求的兩難尷尬局面。 目前國內(nèi)血小板主要保存方式是22℃振蕩保存，有效期為 5d。 此外血小板還可深低溫冰凍保存， 但這種方法的保存效果和臨床療效不確切。 冷凍干燥技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種生物材料的保存， 凍干制品具有常溫下保存、 性能穩(wěn)定、便于運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)。 本研究以過期血小板為原料，探索血小板凍干再水化的條件，檢測其凍干再水化后凝血功能的變化， 為過期血小板再利用及新鮮血小板冰凍或低溫保存研究提供了依據(jù)。
1、材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 血小板來源 實(shí)驗(yàn)組選擇體檢合格， 一周內(nèi)未服用阿司匹林等抗血小板藥物的自愿獻(xiàn)血者，用血細(xì)胞分離機(jī)單采富含血小板血漿，22℃振蕩保存 5d 過期;對照組選擇新鮮機(jī)采血小板。
1.1.2 主要試劑和溶液 海藻糖 (CH22O11·2H2O，北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司); 牛血清白蛋白(BSA，上海生工生物工程有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS); 血小板聚集誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(ADP，Sigma公司);凝血酶(Sigma 公司);膠原(Sigma 公司);瑞斯托霉素(Sigma 公司);CD62P-PE(Bioscience 公司);PAC-1-FITC(BDIS 公司 ); 海藻糖加載緩沖液 ( 含50mmol/L 海藻糖，100mmol/L NaCl，10mmol/L KCl，10mmol/L EGTA，pH 為 6.8);凍干保護(hù)劑(含 20%海藻糖 ，1% 牛血清白蛋白 ，9.5mmol/L HEPES，142.5mmol/L NaCl，4.8mmol/L KCl，1mmol/L Mg-Cl2);復(fù)水溶液為 PBS 緩沖液和蒸餾水以 3:1 比例混合制成。 以上試劑和溶液均在有效期內(nèi)。
1.2 主要儀器 冷凍干燥機(jī)(LabConco，美國);恒溫振蕩水浴(Bellco Glass，美國);流式細(xì)胞儀(FACS-Calibur，BD，美國);血球計(jì)數(shù)儀(CELL-DYN 1700，Abbott，美國);血小板聚集儀(APACT-2 型)。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 血小板的凍干保存 血小板濃縮液離心洗滌后重懸于海藻糖加載緩沖液中， 將上述懸浮液轉(zhuǎn)移進(jìn)入離心管中，并用聚四氟乙稀生料帶密封，于37℃水浴中振蕩孵化 4h。 將孵化后的'血小板懸浮液 800g 離心 3min。 去除上層孵化液，得到沉淀的血小板塊，加入凍干保護(hù)液打散重懸，使用血球計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)， 調(diào)節(jié)血小板在凍干保護(hù)液中的濃度為 1×109個(gè)/ml。 將制備好的血小板凍干懸浮液裝入特制凍干血盒中，密封充注口。 將血小板凍干懸液先以 20℃/min 的速率凍結(jié)至-40℃， 預(yù)凍 2h后，再以 1.5℃/min 對擱板升溫至-30℃，退火 0.5h，然后進(jìn)入一次干燥，-38℃維持一次干燥條件 20h，最后以 0.2℃/min 的加熱速率使隔板溫度升高至20℃，維持二次干燥條件 10h 直至凍干結(jié)束。 凍干的血小板密封保存在室溫。
1.3.2 凍干血小板的水化 將 PBS 緩沖液和蒸餾水以 3:1 的比例混合制成血小板凍干復(fù)水液，將1ml 復(fù)水液在室溫下直接加入凍干樣品瓶中，輕輕震蕩直到樣品完全溶解于復(fù)水溶液中。
1.3.3 檢測血小板回收率 用血球計(jì)數(shù)儀分別對凍干前和凍干再水化后的血小板計(jì)數(shù)， 計(jì)算凍干再水化血小板回收率。凍干再水化血小板回收率(%)=凍干再水化后血小板計(jì)數(shù)/凍干前血小板計(jì)數(shù)×100%。
1.3.4 檢測血小板穩(wěn)定性 凍干再水化血小板分別在室溫放置 0h、2h、4h、6h、8h 后，用血球計(jì)數(shù)儀測定血小板回收率。
1.3.5 血小板形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察 用掃描電鏡觀察血小板的形態(tài);分別以戊二醛固定、脫水、環(huán)氧樹脂包埋后制作超薄切片， 用透射電鏡觀察血小板超微結(jié)構(gòu)變化。
1.3.6 血小板聚集反應(yīng)檢測 將凍干血小板復(fù)水后轉(zhuǎn)入離心管中進(jìn)行洗滌以去除細(xì)胞外保護(hù)劑，再用新鮮冰凍血漿重懸血小板， 調(diào)整血小板濃度為(0.2~0.3)×1012/L。 用 APACT-2 型血小板聚集儀檢測凍干再水化后血小板對四種同濃度誘導(dǎo)劑—凝血酶、膠原、ADP 和瑞斯托霉素的聚集反應(yīng)。
1.3.7 血小板表面糖蛋白檢測 用三色流式細(xì)胞儀分別檢測凍干再水化血小板表面激活指標(biāo) CD62p和 PAC-1 的表達(dá)，經(jīng)凝血酶激活后測定 CD62p 和PAC-1 的再表達(dá)。 再表達(dá)率=凝血酶處理后表達(dá)率-血小板表達(dá)率1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用 SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理， 組間差異比較用 t 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2、結(jié)果
2.1 血小板回收率及穩(wěn)定性 實(shí)驗(yàn)組和對照組間血小板計(jì)數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，凍干再水化血小板回收率為 49.36%，見表 1;凍干再水化血小板穩(wěn)定性隨血小板放置時(shí)間的延長， 血小板回收率逐漸下降，見圖 1。
2.2 血小板形態(tài)及超微結(jié)構(gòu) 掃描電鏡顯示新鮮血小板透光性較強(qiáng)，形態(tài)呈圓形或橢圓形，邊緣光滑， 而凍干再水化血小板透光性較弱， 血小板變形，見圖 2A 和 B。 透射電鏡顯示新鮮血小板著色較深，α 顆粒、致密顆粒、過氧化酶顆粒等分散、清晰，而凍干再水化血小板著色較淺，致密顆粒及 α顆粒不夠清晰，且數(shù)目少于對照組，見圖 2C 和 D。
2.3 聚集反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)組和對照組間血小板同濃度誘導(dǎo)劑下的最大聚集率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組血小板對凝血酶、膠原、ADP 和瑞斯托霉素的聚集功能較對照組均出現(xiàn)下降，見表 2。
2.4 血小板表面糖蛋白 實(shí)驗(yàn)組 CD62p 表達(dá)率和再表達(dá)率分別為 50.25%、94.27%，均顯著高于對照組的 8.12%、78.43%(P<0.05);凝血酶作用后 CD62p再表達(dá)率為 44.02%，顯著低于對照組 70.31% (P<0.05)。 實(shí)驗(yàn)組 PAC-1 表達(dá)率為 3.85%，與對照組相比較無顯著性差異 (P>0.05)，PAC-1 再表達(dá)率為42.75%，顯著低于對照組 67.29%(P<0.05)，凝血酶作用后 PAC-1 再表達(dá)率為 38.90%，顯著低于對照組 65.28%(P<0.05)，見表 3。
3、討論
血小板數(shù)目減少或功能不全所致出血性疾患的預(yù)防和治療，臨床多采用輸注血小板制劑。 血小板保存技術(shù)的缺陷是血小板過期浪費(fèi)和臨床供不應(yīng)求的兩難處境的主要原因，因此，研究出一種能長期、高效、安全和方便的血小板保存方法一直是國內(nèi)外輸血工作者關(guān)注的熱點(diǎn)和難題。
將過期的血小板再利用及血小板的凍干保存有著廣闊的應(yīng)用前景。 本研究顯示凍干再水化的過期血小板回收率及穩(wěn)定性較差， 說明凍干和再水化過程對血小板功能造成一定影響， 應(yīng)進(jìn)一步改進(jìn)凍干保存時(shí)擱板溫度，復(fù)水液組分和比例，以及增加預(yù)復(fù)水步驟。 透射電鏡下新鮮血小板著色相對較深， 可能為新鮮血小板生物活性較高或膜通透性相對較高，因而有較強(qiáng)吸附染料的能力。
CD62p 和 PAC-1 分別為血小板表面活化晚期標(biāo)志物和活化早期的標(biāo)志物， 結(jié)果顯示過期血小板對凝血酶、ADP、 膠原及瑞斯托霉素的最大聚集率明顯小于新鮮血小板，凝血酶作用后 CD62p 和 PAC-1 的再表達(dá)率低于新鮮血小板，說明過期以及凍干和再水化過程對血小板凝血功能有影響， 但凍干再水化的過期血小板仍具有一定的存活能力和功能活性， 因此選擇血小板進(jìn)行冷凍干燥保存是血小板長期保存切實(shí)可行的方法， 為新鮮血小板冷凍干燥保存提供理論依據(jù)。 但對該方法保存血小板的回收率、 穩(wěn)定性以及凝血功能等還需做進(jìn)一步研究與改進(jìn)，以達(dá)到臨床應(yīng)用的要求。
參考文獻(xiàn)：
[1]王捷熙,楊超,王艷,等.小分子糖負(fù)載血小板+凍干保護(hù)劑混合懸液的相變點(diǎn)測定與屏蔽實(shí)驗(yàn)研究[J].中國輸血雜志,2010,5(23):338-340.
[2]王捷熙,韓穎,楊超,等.生物化學(xué)穩(wěn)定法冰凍干燥血小板制劑的功能研究[J].中國輸血雜志,2010,5(23):341-343.
[3]池春燕,林力紅.外科 DIC 患者輸注冷沉淀凝血因子的療效觀察[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2014,32(1):53-56.
[4]鄧日富.臨床用血情況分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,31(4):388-389.
[5]徐祥蓮,王麗,徐晶,楊娟,等.2008 年至 2011 年南昌市地區(qū)捐獻(xiàn)機(jī)采血小板情況分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(6):615-616.
[6]周俊,張長虹,劉景漢,等.凍干血小板功能的體外評價(jià)[J].中國輸血雜志,2008,10(21):774-777.
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