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降解對硝基苯胺的混合培養微生物
摘要：通過富集培養，獲得了降解對硝基苯胺的混合培養微生物。結果表明，對硝基苯胺降解速度和混合培養微生物生長對外加碳源有較強的依賴性。在培養液中添加1•0 g/L葡萄糖和1•0 g/L酵母粉，36 h內對硝基苯胺去除率可達97%以上，對硝基苯胺降解速率可達4•1 mg/L•h;當對硝基苯胺作為培養液生長的唯一碳源、氮源和能源時，96 h內對硝基苯胺去除率為34•8%，降解速率為0•15 mg/L•h。
關鍵詞：對硝基苯胺;生物降解;混合培養;純培養
1、引言
硝基苯胺(NA)的3種異構體:鄰硝基苯胺、間硝基苯胺、對硝基苯胺，是印染、橡膠、制藥、塑料和油漆等行業的重要原料，是染料工業的中間體。這3種化合物可通過呼吸道、消化道而攝入體內，使氧和血紅蛋白變為高鐵血紅蛋白，影響組織細胞供氧而造成內窒息，且被認為對人體有很強的致癌性[1]。苯胺類化合物對環境的污染一直被人們所關注，我國把苯胺類化合物列入環境中的重點污染物，并制定最高容許排放濃度5 mg/L。
此類化工廢水治理較為困難，國內研究較少，至今為止絕大多數采用物理[2，3]、化學[4~6]的方法加以處理，但這些方法處理費用偏高，操作要求較為嚴格，實際上難以推廣運用，因而迫切需要尋找一些行之有效的、費用相對低廉的處理方法。本研究以對硝基苯胺為目標污染物，通過富集培養某化工廠好氧處理池的污泥，獲得了對該污染物降解效果較好的混合培養微生物，用該微生物作為降解菌源，對對硝基苯胺的生物降解特性進行了初步的實驗研究。
2、實驗材料與方法
2.1 菌種來源
菌種來自某化工廠廢水處理系統好氧池污泥。
2.2 試驗儀器及設備
恒溫搖床;7500分光光度計;pH計;高速離心機。
2.3 培養液及微量元素
降解菌培養基
K2HPO4.3H2O 430 mg/L; KH2PO4•7H2O170 mg/L;MgSO4•7H2O22•5 mg/L;CaCl2 27•5 mg/L; NaEDTA 100 mg/L; Na2HPO4•7H2O 668 mg/L。
基礎無機鹽培養基
KH2PO41 000 mg/L; Na2HPO4•12H2O 7 000 mg/L;檸檬酸鐵40 mg/L; CaCl2•2H2O 100 mg/L; MgSO4•7H2O 300 mg/L; pH7•35。
YPS培養液
酵母粉10 g/L;蛋白胨10 g/L;氯化鈉5 g/L。
微量元素(TMS)
FeCl3•6H2O;ZnCl2•4H2O; CoCl2•2H2O;Na2MoO4•2H2O; CaCl2•2H2O; CuSO4• 5H2O;H3BO4;HCl等。
基礎無機鹽/TMS/YE培養液 每1 L無機培養液中添加3 mL微量元素和1 g無菌酵母粉。
2.4 研究內容與方法
2.4.1 降解菌的分離
(1)富集培養 菌種馴化過程在30℃的恒溫室中進行。首先取5 mL新鮮的活性污泥加入到盛有50 mL YPS培養液的250 mL錐形瓶中，在120 r/min 轉速下，連續振蕩培養24 h，然后從中取10%培養液轉接到新鮮的YPS培養液中。在相同的條件下繼續培養24 h，從中取5 mL作為接種菌液，加入到含20 mg/L對硝基苯胺的基礎無機鹽/TMS/YE培養液中，10 d左右培養液原黃顏色褪去。再取10 mL培養液轉接到新鮮的含對硝基苯胺基礎無機鹽/TMS/YE培養液中，2 d后培養液黃顏色也褪去。把此種培養液作為降解試驗的接種菌液，菌體的OD值大約1.2 左右，降解特性試驗中菌體的接種量為10 mL。
(2)純培養 從降解速率較高的富集培養物中取樣，在含有對硝基苯胺平板上劃線分離，放置于30℃恒溫室內培養數天，觀察菌落生長情況，把形成的耐受力強單菌落挑斜面保存(即為純培養物)。
2.4.2 對硝基苯胺降解特性試驗
pH值 對硝基苯胺初始濃度為50 mg/L，調節混合培養液初始pH值，置于30℃恒溫室振蕩培養36 h后，以初始培養液為空白參比測定OD值以及對硝基苯胺去除率，確定混合培養微生物生長適宜的pH值范圍。
外加碳源 對硝基苯胺初始濃度約為50 mg/L、100 mg/L，pH值約為7.5，分別添加0、0.5、1.0 g/L葡萄糖條件下，探明微生物能否利用對硝基苯胺作為生長的唯一碳源、氮源和能源，以及不同葡萄糖量對微生物生長及對硝基苯胺去除率的影響。
基質濃度 對硝基苯胺初始濃度約為50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L，pH值約為7.5，間隔一定時間取樣，測定培養液中對硝基苯胺濃度、pH及OD值的變化。通過微生物的生長曲線、基質降解曲線等過程來分析該混合培養微生物的基本特性。
2.5 分析項目和測定方法
對硝基苯胺濃度 采用分光光度法[7]，在最大吸收峰(λmax= 360 nm)測定其吸光度�；旌弦航�9 000 r/min高速離心5 min，取上清液測定，根據標準曲線推算其濃度。若對硝基苯胺濃度超過10 mg/L均稀釋后測定。
菌體濃度OD值 采用分光光度法，混合液充分搖勻后直接在波長λ=600 nm測定其吸光度。溶液的菌體濃度等于實際測定的OD值減去空白值(不接菌液)的OD值。
pH值 混合液充分搖勻后直接用pH計測定。
3、結果與討論
3.1 pH值對降解的影響
混合培養微生物對硝基苯胺初始濃度約為50 mg/L，在不同初始pH值條件下，經30℃恒溫振蕩培養36 h后，其菌體濃度OD值和對硝基苯胺去除率關系。從圖中可以看出微生物生長適應pH值范圍較寬，在初始pH值為6•5~8•5條件下生長均較好。這與國外研究者的研究結果[7~8]相吻合———能降解硝基苯類化合物的Pseudomonas sp.、Comamonas testosteroni、Bacillas sp.、Acidovorax delafiedii菌屬最適pH值為6.5~8.5，可以說pH值也是影響降解速率的重要因子。實驗中發現，混合培養微生物初始pH值為3.2、3.7時，其菌體OD值均<0.4，去除率也很低;pH值為3.7時去除率為19.5%，而pH值為3.2時幾乎未見有降解。這說明該混合培養微生物中對硝基苯胺降解菌不適宜在較低的p
H值下生長，但仍具有一定的耐酸性。
值得注意是，當初始pH值大于8.5，甚至達到10•2時，混合液OD值還是比較高，均超過1•2，但對硝基苯胺去除率幾乎為零。這是由于混合液中添加了1•0 g/L葡萄糖和1•0 g/L酵母膏的緣故。葡萄糖作為外加碳源，提供了微生物生長的電子受體，促進了非對硝基苯胺降解菌的生長。
3.2 不同碳量對降解的影響
不同碳量對微生物的生長和對硝基苯胺降解速率的影響結果.混合微生物能利用對硝基苯胺作為生長的唯一氮源，適量的外在碳源對微生物的生長有很大的促進作用，混合液的菌體濃度隨外在碳源(葡萄糖)添加量的增加而增大。但混合液中不添加葡萄糖時，即對硝基苯胺作為微生物生長的唯一碳源、氮源和能源，菌體濃度明顯小于添加外在碳源的混合液，最終OD值只有0.05。
對于不同底物濃度葡萄糖添加量對對硝基苯胺去除率的影響。當底物對硝基苯胺濃度為41 mg/L時，不添加外在碳源，96 h內去除率為34.7%。而添加0.5 g/L葡萄糖外在碳源，前24 h對硝基苯胺降解速率要快于添加1.0 g/L葡萄糖的培養液，24 h之后其降解速率要慢于后者，但最終去除率都能達到97%左右。從圖4可以看出，當底物對硝基苯胺濃度為83 mg/L左右時，葡萄糖的添加量越多，對硝基苯胺的降解速率越快，在24 h之后表現的更為明顯，最終的去除率分別為16.8%、72•2%和96.8%。
從以上的分析可以說明對硝基苯胺作為難降解有機物，并不是混合微生物新陳代謝理想的碳源。有研究表明[9]，此種難降解化合物在被降解之前，往往需要利用一些簡單的碳源�；旌衔⑸锢贸跫壧荚�(葡萄糖)生長，并產生相應的誘導酶，從而使對硝基苯胺得到降解。
3.3 不同底物濃度對降解的影響
不同底物濃度對對硝基苯胺去除率的影響。從圖中可以看出，對硝基苯胺降解速率隨著底物濃度的增加而下降。當底物濃度較低時(43•03 mg/L)，對硝基苯胺降解速率明顯要高于其它底物濃度較高的培養液。然而當底物濃度增加到一定程度(83•03 mg/L)后，基于高濃度有機物毒性對酶的抑制作用，降解速率比較緩慢，降解速率也比較相近.
3.4 混合培養與純培養對對硝基苯胺降解效率比較
混合培養對對硝基苯胺的去除率要明顯高于純培養。純培養對對硝基苯胺的最高去除率只有0.07左右，比混合培養97%的去除率要小很多。有研究表明聚乙烯醇(PVA)的生物降解需要混合菌完成[9]，一般是pseudomonas sp.和Alealigenes sp.或2株不同的pseudomonas sp.，它們之間靠一種共生關系來完成PVA的降解。Murray[10]對Bacteroides cellulosolvens和Clostridium saccharolyticum混合培養分解纖維素進行研究發現，前者分解纖維素為后者提供生長所需碳源，后者又可利用前者產生的有毒中間產物，消除對前者分解纖維素的反饋抑制。
Mori[11]認為，Clostridium Thermohydrosulfurium YM3和C.ThermocellumYM4混合培養降解纖維素效果明顯高于單菌培養，主要原因是2種菌互相提供了對方所需的生長因子。本實驗的結果也可以證明，混合菌對有機物的去除率要高于單一菌株，但混合菌株之間是以何種關系促成有機物的降解有待于進一步研究。
4、結論
通過富集培養某化工廠的活性污泥獲得了降解對硝基苯胺的混合培養微生物，在好氧條件下對硝基苯胺具有較高的降解速率4•1 mg/L•h。實驗確定了該混合培養物的適宜生長條件:pH為6•8~8•5，溫度為30℃左右。該混合培養物能利用對硝基苯胺作為生長的唯一碳源、氮源、能源，但降解速率較慢。適量的外加碳源可以大大的提高對硝基苯胺的降解速率�；旌吓囵B微生物的降解速率要明顯的高于純培養的單一菌種，因此尋找高效好氧降解菌，仍是今后研究的一個重點。
參考文獻:
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