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論視神經離斷對神經干細胞定向誘導分化的影響
[論文關鍵詞]干細胞；組織培養；視網膜神經節細胞；細胞分化；
[論文摘要] 目的 探討大鼠視神經離斷對神經干細胞一上丘組織共培養誘導分化的影響。方法采用機械分離，無血清選擇培養的方法從孕14d的胚鼠上丘中獲取神經干細胞并進行傳代培養。使用免疫熒光技術對神經干細胞進行鑒定。采用顯微手術的方法建立大鼠視神經離斷模型，分別取正常大鼠、假手術和視神經離斷大鼠的上丘組織進行體外培養。使用組織一細胞共培養系統將大鼠上丘組織與神經干細胞共培養，觀察干細胞分化過程，對分化細胞進行鑒定，并與干細胞的自然分化過程進行比較。結果從胚鼠上丘中獲得的細胞在無血清培養條件下聚集呈球形懸浮生長，可形成單細胞克隆，具有多向分化能力，經免疫熒光鑒定證實為神經干細胞。視神經離斷大鼠的上丘組織與胚胎上丘源神經干細胞共培養可以促進神經干細胞的分化，并誘導分化出Thyl.1陽性的視網膜神經節細胞。結論從胚胎大鼠上丘可以分離培養出神經干細胞，與視神經離斷大鼠的上丘組織共培養可以誘導上丘源神經干細胞分化為視網膜神經節細胞。
1材料與方法
1.1主要材料和試劑
孕14d和3個月齡SD大鼠均由復旦大學醫學院實驗動物中心提供。高糖DMEM／F12、Neurobasa1、N2、B27購自美國Gibeo公司；EGF、b-FGF購自美國R&D公司；小鼠抗Nestin單克隆抗體、小鼠抗Thyl.1單克隆抗體購自美國Chemieon公司；兔抗GFAP購自武漢博士德公司；兔抗MAP-2單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。
1.2動物分組與視神經離斷模型
取3個月齡sD大鼠30只，雌雄不拘，隨機分為3組：正常對照組、假手術組和視神經離斷組，每組動物均為10只。視神經離斷組大鼠隨機選擇一側眼，在手術顯微鏡下鈍性分離顯露視神經；在離后極約2 mm處剪斷視神經。術后于直接檢眼鏡下觀察視網膜血供良好者納入試驗。假手術組動物外科操作同視神經離斷組，但不離斷視神經。正常對照組則不做任何處理。
1.3胚胎上丘NSCS的分離與培養
取孕14d的SD大鼠，孕鼠孕齡的計算方法為：將雌雄大鼠合籠后，次晨檢查發現陰栓者為孕0天。按照大鼠腦解剖圖譜細心分離出上丘組織。胚胎上丘NSCS的分離與原代培養程序參見馮東福等已建立的方法。
1.4單細胞克隆及鑒定
將第2代的神經干細胞球，吹打成單細胞懸液。使用連續稀釋法，最終細胞密度為100／ml。參照Reynolds和Weiss的方法，建立單細胞克隆。
使用細胞免疫熒光法對傳4代的細胞克隆進行鑒定，一抗為小鼠抗Nestin單克隆抗體(1:100)，二抗為羊抗小鼠IgG Cy3(1:10)。使用TCS-SP2型激光共聚焦顯微鏡對熒光標記后的細胞克隆球進行觀察，并進行計算機三維圖像重建，激發波長為543mm。具體方法見馮東福等的報道。
1.5上丘組織培養
假手術組和視神經離斷組大鼠在術后5d斷頭處死，取手術對側的上丘組織，正常對照組隨機取單側上丘組織。上丘組織培養采用我們已經建立的方法。
1.6雙室組織一細胞共培養系統
該系統由上下兩室組成。上室為透明PET微孔(孔徑0.4μm)濾膜培養小室(Becton Dickinson產品)，下室為配套的24孔培養板，可將上室懸吊起來。共培養時將上下室組合起來。
1.7神經干細胞的自然分化
取傳4代的NSCS懸液，從500r／min離心5min，棄上清，加入干細胞分化培養液(Neurobasal培養液+B27(1：50)+10％FBS+谷氨酰胺4 mmol／L)輕柔吹打。調整細胞密度為1×105／ml后將1 ml懸液滴入下室，上室中不放組織塊，僅加入分化培養液。把接種后的雙室組織一細胞共培養系統放人C02培養箱中于37℃ 、5％CO2條件下貼壁培養。隔日用相差顯微鏡觀察細胞生長分化情況，貼壁培養14d后進行熒光免疫細胞化學染色。1.8上丘組織一神經干細胞共培養誘導分化
將傳4代的NSCS懸液以500r／min離心5min，棄上清，加入分化培養液輕柔吹打，調整細胞密度為1×105／ml后取1ml懸液滴入下室中于37℃ 5％C02條件下貼壁培養。3d后將已在體外培養4d的上丘組織移入共培養系統進行共培養。6d后將上室移去，神經干細胞繼續培養至14d。
1.8分化細胞的鑒定
細胞免疫熒光染色步驟同前，根據需要上不同的一抗，抗體工作濃度分別為：MAP-2(1:50)、GFAP(1:100)、Thyl.1(1:100)。根據不同的一抗選擇FITC或Cy3熒光二抗。陰性對照使用PBS液代替一抗。對Thyl.1陽性的培養孔，每孔隨機選擇3個克隆，在細胞疏松區域選擇4個不同視野，記數總細胞數和Thyl.1陽性細胞數，計算陽性率。
2 結果
2.1 上丘神經干細胞克隆形成及鑒定
大鼠胚胎上丘細胞接種48h后培養液明顯黃變，大部分細胞死亡，存活的部分細胞胞體增大，折光性增強，伴有明顯光暈。部分細胞出現分裂相，細胞可成對出現。隨著培養時間的延長，細胞團逐漸增大，呈球形懸浮生長，邊緣細胞折光性較強。對第2代細胞進行單細胞克隆培養后發現，細胞可形成亞克隆，這些來自單個細胞的亞克隆可以進行傳代培養，并大量增殖。
使用激光共聚焦顯微鏡，進行三維重建后可以清晰地看到克隆球呈Nestin陽性，中心的細胞較為
2.2分化細胞的鑒定
NSCS的自然分化和各共培養組合誘導分化分化情況。各組神經干細胞大部分均分化為GFAP陽性的神經膠質細胞。少量分化為MAP-2陽性的神經元。但只有上丘源NSCS與視神經離斷組的上丘組織共培養后可見有Thyl.1陽性的視網膜神經節細胞分化。在該組分化的細胞中，Thyl.1陽性細胞的比率為14.92％
2.3神經干細胞的自然分化
神經干細胞克隆在撤除絲裂原24h后貼壁。隨著時問延長克隆球逐漸變扁平，并以克隆為中心產生放射狀細胞遷移�？寺∏蜻吘壍募毎螤钶^不規則，多數細胞呈梭形或多角形，發出短而細的突起。7d后部分細胞可見長突起，細胞的折光性也各有不同。在相差顯微鏡下可見胞體較疏松，邊緣部分有散在的遷移細胞，部分細胞可見有突起發出，亦呈Nestin陽性。 大、形態不規則、具有多個粗突起的膠質樣細胞數量較多。而胞體有很強光暈，呈圓形或橢圓形、具有1～2個細長突起的神經元樣細胞數量較少。隨著神經干分化時間的延長，克隆球四周的細胞逐漸增多，遷移的距離也逐漸增加。在培養2周時出現大量細胞遷移，而克隆球邊緣則逐漸模糊
2.4組織-神經干細胞共培養誘導分化
上丘神經干細胞經與組織共培養24h后均貼壁生長，克隆球逐漸變扁平。部分克隆球邊緣有細胞突起發出，開始分化過程。在培養48h后可見細胞向外遷移，在相差顯微鏡下呈明顯的“太陽征”在培養5d時，以克隆為中心產生的
3 討論
雖然干細胞的體外誘導分化已經有較多研究，但在體外誘導NSCS向RGCs分化，特別是采用上丘組織與NSCS共培養誘導分化的研究目前還未見報道。筆者采用了一種新型的雙室共培養誘導NSCS分化模式，細胞與組織不在一個平面上。下室為多聚賴氨酸包被的培養板，用于細胞培養。上室底部的PET膜使用細胞外基質包被，并經過蝕刻處理，有利于細胞的遷移，其組織貼壁率明顯優于傳統培養載體。組織接種到小室底部PET膜上后，與下室組合在一起進行共培養。由于PET膜上分布的孔徑為0.4μm，所以膜上細胞分泌的分子會穿過PET膜孔到達下面，但細胞卻無法進行直連續放射狀細胞遷移，這些細胞的形態大多是圓形或梭形，多數細胞有較長突起，也有一些細胞體未見明顯突起長。在培養2周后，大部分克隆明顯減小，而不同克隆分化出的細胞交織成網，細胞間的突起相互連接。接接觸，因此可以排除細胞接觸因素的影響。
在哺乳動物中樞神經系統的發育過程中，各種神經元與對應的靶組織建立突觸聯系往往是其存活和進一步成熟分化的重要條件。大鼠出生時視覺系統尚未成熟，視網膜神經細胞，特別是節細胞，在出生后的成熟和分化，皆有賴于其靶組織一中腦上丘提供神經營養和誘向因子。因此筆者通過將NSCS與RGCS的靶組織共培養的方法，探討靶組織在體外環境下對NSCS分化的影響。筆者發現視神經離斷成年大鼠的上丘組織均可誘導NSCS分化為RGCS，而假手術組和正常對照組的上丘組織則無此作用。
上丘對RGCS的作用是通過一系列復雜的化學因子調節的，其中較為重要的是神經營養因子的作用。Frost等報道在上丘中腦源性神經營養因于的表達水平與RGCS發育程度相關，出生后15d內的倉鼠上丘BDNF保持在較高水平，而在成年期其含量下降約1／3左右。Kretz等則發現另一種神經營養因子——睫狀神經營養因子在發育期上丘的表達也具有同樣的時間依賴性。這些神經營養因子在發育期的高表達，對于神經干細胞的增殖、分化同樣具有重要作用。筆者從胚胎大鼠上丘組織中成功分離出具有多向分化能力的NSCS，也說明發育期的上丘組織存在NSCS存活、分化的微環境。
但對于成年動物，上丘對視網膜細胞的促進生長作用逐漸消失。而在視神經離斷后，上丘可以再現胚胎期對視網膜神經節細胞的誘向作用。在胚胎發育過程中，未成熟星形膠質細胞表達vimentin，但隨著發育完成vimentin的表達逐漸消失。在成年動物上丘中，已無vimentin表達。但在視神經損傷后，上丘組織中再次出現了vimentin陽性表達的未成熟星形膠質細胞。視神經損傷的發生激活了星形膠質細胞的“再發育”，這些細胞類似于胚胎上丘細胞的vimentin陽性細胞，可以分泌視網膜細胞發生所需要的神經營養和誘向因子。此外，視神經損傷后的上丘組織中還出現了小膠質細胞的大量增殖，這些小膠質細胞對星形膠質細胞各種細胞外基質(ECM)的表達具有重要作用。ECM是由各種糖蛋白、黏蛋白、神經黏附因子等組成，在空間上是神經微環境的重要組成部分，可以通過調整黏附和信號分子的聚集，起到微環境信號放大器的作用。
存筆者的實驗中，正常成年大鼠上丘組織雖然也可以在體外培養條件下生長，但并不能誘導NSCS向視網膜神經節細胞分化。而上丘源NSCS與視神經離斷后5d的大鼠上丘組織共培養則可以向RGCS分化，這可能與視神經離斷后上丘細胞發生的一系列功能的“激活”有關。由于筆者采用的共培養系統排除了細胞間直接接觸的影響，因此，視神經離斷后上丘細胞可能通過分泌某種因子對NSCS的分化方向產生影響。對相關因子的進一步研究將可能有助于對視神經損傷再生機制的了解。同時，體外誘導NSCS定向分化為RGCS的成功也為視神經損傷修復提供了新的細胞來源。然而，這些分化而來的RGCS雖然通過細胞免疫學檢測證明。
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