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小鼠胚胎干細胞定向分化為神經細胞的研究進展
【關鍵詞】 胚胎干細胞; 神經細胞; 分化
Progress in directed differentiation of mouse embryonic stem cells into neural cells
【Abstract】 Mouse embryonic stem cells can give rise to ectodermal derivatives in culture and can be further induced into neurons and glia for cell-replacement therapies in the central nervous system and for use in drug discovery. The methods of directed differentiation of mouse embryonic stem cells into neural cells include neural differentiation from embryonic stem cells via embryoid bodies, stromal cell induced neural differentiation, default model mediated neural differentiation, adherent monoculture induced neural differentiation, genetic engineering mediated neural differentiation and so on. Here we review these methodologies.
【Key words】 embryonic stem cell; neural cell; differentiation
小鼠胚胎干細胞于1981年首次由Evans和Kaufman［1］成功分離建系，它們來源于胚泡的內細胞團（inner cell mass , ICM），這些細胞具有穩定的二倍體核型，在體外可以分化為三個胚層的多種細胞。將小鼠胚胎干細胞重新植入胚泡可以參與形成胚胎。體外ES細胞維持未分化狀態依賴于一些細胞因子的存在，如白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor , LIF）［2］。撤去這種自我更新的刺激信號后，ES細胞很快分化為多種細胞。這些屬性使ES細胞成為非常有用的發育生物學和功能基因組學研究的生物系統［3］。
1 擬胚體（embryoid bodies, EBs）內神經細胞的分化
小鼠ES細胞通過擬胚體分化為神經細胞主要有以下兩種方案。
1.1 “4-/4 方案”［4］ 將小鼠ES細胞無LIF培養4天，形成EB；再用維甲酸（retinoic acid, RA）處理4天，然后在明膠（gelatin）［5］或層粘連蛋白（laminin）［4］包被的組織培養皿上培養［6］。培養6天后，細胞出現明顯的神經細胞形態，開始表達神經細胞特異的基因，如神經微絲輕鏈（neurofilament light chain）、微管相關蛋白2和5（MAP2、MAP5）等。這些細胞對一系列神經遞質和去極化電流起反應，證實了它們是可以傳遞興奮的神經元。這一方案還會分化出神經膠質細胞，多數為星形膠質細胞，但也有少突膠質細胞的存在［7］。RA是一類促神經生長因子，不僅對多潛能干細胞有誘導作用，對神經前體細胞也有促進增殖、成熟的作用。RA與受體RAR、RXR結合，后者活化后與RA反應元件（RARE）結合，激活神經細胞相關基因并抑制中胚層相關基因的轉錄［8］。Wiles 等人的實驗表明RA通過激活抑胰蛋白（follistatin）抑制骨形態形成蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）而使小鼠ES細胞向神經細胞方向分化［9］。
該方案時間短、成本低，是目前使用較為廣泛的神經細胞誘導方法。其不足之處是EB的外層細胞先分化而內層細胞仍保持未分化狀態, 分化不均一，得到的細胞種類復雜，不利于純化。
1.2 “五步法”方案［10］ (1)擴增未分化的胚胎干細胞；(2)去除分化抑制劑或促有絲分裂素，ES細胞開始分化，不貼壁懸浮生長，形成EB；(3)去除生長因子，選擇巢蛋白（nestin）陽性細胞（即神經前體細胞）；(4)使用神經細胞培養液，添加生長激素、神經營養因子，擴增神經前體細胞；(5)利用促神經元存活因子誘導并維持神經元成熟。該方案不用RA處理EB，而是將EB在一種選擇性的無血清培養基上培養。因為EB中的非神經細胞不能在這種培養條件下生存，所以大部分存活下來的細胞是nestin陽性的神經前體細胞［11］。這些神經前體細胞可被高效地誘導分化為神經元［12］。
該方案的主要優點是在進一步分化為神經元或神經膠質細胞之前，神經前體細胞已經得到較高的純化，這有利于特定類型神經細胞的獲得。但是，其操作較“4-/4 方案”復雜，而且多種生長激素、神經營養因子的應用增加了成本且不利于分化機制的闡明。
通過EB途徑由ES細胞分化而來的神經元多數為γ-氨基丁酸（GABA）能神經元，少數是谷氨酰胺能神經元。通過改變誘導分化的條件，可以得到不同類型的神經元或神經膠質細胞，并提高分化效率。腹側中腦和后腦是多巴胺能神經元和5-羥色胺能神經元產生的部位，SHH(sonic hedgehog)和FGF-8（fibroblast growth factor-8）對這兩部分的形態發生起重要作用［13］，Lee等人［10］用這兩種分子處理EB來源的神經前體細胞得到了多巴胺能神經元和5-羥色胺（5-HT）能神經元。 2002年Wichterle等人［14］用背側分子（RA）和腹側分子（Hh-Ag1.3,一種SHH的拮抗劑）處理EB，得到了腹側脊髓運動神經元。2005年Tsuchiya等人［15］在經典的“五步法”方案基礎上，在第五步除去bFGF（basic fibroblast growth factor），用含有層粘連蛋白的N2培養液中成功誘導分化出微小膠質細胞，并進一步用含有胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和粒單細胞集落刺激因子（GM-CSF）的RPMI-1640培養液擴增細胞，得到89.0%的微小膠質細胞。
2 基質細胞誘導的神經細胞的分化
第二類誘導神經細胞分化的方法是基質細胞誘導方法，該方法的誘導機制尚不清楚，目前稱為“基質細胞來源的誘導活性作用（stromal cell-derived inducing activity , SDIA）”［16］。
2000年Kawasaki等人描述了一種經基質細胞誘導ES細胞分化為多巴胺能神經元的方法［16］。這一方法中，神經細胞的分化通過ES細胞與小鼠骨髓來源的基質細胞PA-6細胞單層共培養而實現。實驗結果表明，92%的細胞表現為神經細胞黏附分子（nerve cell adhesion molecule, NCAM）陽性，其中多數為酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase, TH）陽性細胞。酪氨酸羥化酶是多巴胺生物合成的限速酶，因此是多巴胺能神經元的一個很好的分子標志。2005年Yamozoe等人［17］用含有肝素的磷酸鹽緩沖液沖洗培養的PA-6細胞得到含有所謂神經誘導因子（neural inducing factors, NIF）的溶液，用此溶液培養小鼠ES細胞，發現小鼠ES細胞可以在含有33%NIF溶液的培養液中生存，并且隨著培養液中肝素濃度的增加，ES細胞分化為神經細胞的比例也增高。值得注意的是，PA-6細胞介導的神經細胞分化受到血清或BMP-4的抑制，血清和BMP-4的加入可引起ES細胞分化為多種非神經細胞。PA-6細胞的SDIA作用并不能使所有類型的干細胞誘導分化為多巴胺能神經元，例如，2005年Roybon等人［18］報道，對于神經前體細胞，PA-6細胞不能促進其向多巴胺能神經元分化，而是促進其向星形膠質細胞的分化。
2003年Barberi等人［19］描述的一種經基質細胞誘導分化的方法可以將ES細胞分別誘導分化為多種神經細胞。這一方法將小鼠骨髓來源的基質細胞MS5或S17或主動脈-性腺-中腎區來源的原始基質細胞作為飼養層細胞與ES細胞在血清替代培養液中共同培養，得到神經前體細胞，再用不同的細胞因子序貫處理這些神經前體細胞，分別可以得到較高百分比的膽堿能神經元、5-羥色胺能神經元、多巴胺能神經元、γ-氨基丁酸能神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。將得到的多巴胺能神經元注射到6-OHDA誘導的帕金森模型動物的患側紋狀體內，8周后由中樞神經系統興奮劑amphetamine或者紋狀體D1、D2受體激動劑apomorphine所誘導的旋轉不穩定癥狀得到了顯著改善，并且可以在注射細胞的紋狀體內發現大量的酪氨酸羥化酶陽性細胞。
基質細胞誘導神經細胞分化的方法可以高效獲得某種特定的神經細胞，例如，多巴胺能神經元和膽堿能神經元。然而，作用機制還有待進一步闡明。
3 默認模式（default model）介導的神經細胞分化
2001年Tropepe等人［20］發現小鼠ES細胞在低密度、無血清、無飼養層細胞的條件下培養7天后，約0.2%的細胞可形成神經球（neurosphere），并進一步自發分化為神經細胞，這種分化方法稱為默認模式。這是抑制神經分化的信號分子表達降低的結果。Wiles等人［9］發現在神經分化過程中，可以檢測到BMP、TGFβ等基因的表達下調。BMPs在神經發育早期與細胞表面絲/蘇氨酸受體結合激活Smad蛋白，后者進入核內抑制Mash1、Math1、Ngn1/2、NeuroD等轉錄因子的活性，調節下游基因的表達，從而抑制神經分化［21］。BMP4處理的小鼠ES細胞在分化過程中神經元數量大為減少［22］；而用 noggin、follistatin、chordin、Cerberus等BMPs的拮抗劑處理小鼠ES細胞則可促進ES細胞向神經細胞方向的分化。
該方法促進神經分化的效率較低，單獨應用此法誘導神經細胞分化并不多見。
4 單層粘附培養誘導的神經細胞分化
2002年Pacherník等人［23］在不形成EB和不用RA處理的情況下，將小鼠ES細胞生長在含有胰島素（insulin）、轉鐵蛋白（transferrin）、硒元素（selenium）和纖連蛋白的無血清DMEM/F12培養液中，發現分化的細胞多數表達MAP-2等神經細胞的標志性蛋白。2003年Ying等人［24］將細胞密度為0.5～1.5×104/cm2的小鼠ES細胞培養于0.1%明膠包被的組織培養皿上，以N2B27作為培養液，培養4天后，60%以上的細胞分化為神經前體細胞。該方法形成的神經前體細胞具有良好的可塑性：神經前體細胞在N2B27培養液中培養，得到的細胞多數為GABA能神經元；FGF8和SHH處理神經前體細胞可以得到較多的多巴胺能神經元。
此類方法將形成EB的三維培養模式簡化為單層粘附培養的模式，降低了復雜程度，有利于神經細胞分化早期事件的分子機制研究，而培養液中各成分發揮的作用需要進一步闡明。
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