公衛執業醫師考點：炭疽診斷標準及處理原則—附錄A
炭疽細菌學檢查
A1 標本的采取
A1.1 采取標本時必須遵循的兩條原則
A1.1.1 盡可能在抗生素治療開始前采取標本。
A1.1.2 除必要時并在具備操作病毒細菌條件的實驗室內，不得用解剖的方式獲取標本。所需的血液與組織標本，均應以穿刺方式取得。
A1.2 血液標本
所有的疑似人類病例和病畜，都應采取血液標本，標本量至少應滿足下列檢查的需要：
a)涂片進行顯微鏡檢查;
b)接種培養基進行細菌分離培養;
c)分離血清檢查抗體;
d)常規血液檢查。
A1.3 糞便與嘔吐物標本
表現消化道癥狀的可疑病人收集糞便或嘔吐物標本，特別注意選取其中混有血液的部分，置無菌容器中。
A1.4 痰與咳碟標本
表現為呼吸道癥狀的可疑病人應收集其痰液標本，無痰液者，應取供細菌分離培養用的培養基，打開平皿蓋置病人口鼻10cm處;令病人對平皿咳嗽，然后迅速蓋上平皿。
A1.5 腦脊液標本
表現腦膜刺激癥狀的病人，腰椎穿刺獲取腦脊液，標本量參照A1.2的要求。
A1.6 尸體標本
食草動物死于炭疽時，通常會從口、鼻、肛門等腔道開口流出血液，這種血液應是首先采取的標本。如果血液已滲入土壤，則應收集混有血液的土壤作為標本。沒有血液流出，或已不可能獲取血液標本時，可通過穿刺心臟獲得血液或穿刺肝臟等實質性臟器獲得組織標本。
A1.7 肉類標本
如果懷疑罹患炭疽的家畜已被宰殺，或對商品肉類進行常規檢查時，可剪取小塊肉類標本。如有可能，特別應剪取肝臟、脾臟等富含血液以及含淋巴組織的標本。
A1.8 毛皮或其他可疑污染物品標本
剪取小塊毛皮或其他可疑物品，剪碎置無菌試管內，加適量無菌生理鹽水浸泡。
A1.9 水標本
檢查水體污染時，用廣口瓶收集水樣。如須取深層水樣時，將帶蓋廣口瓶伸入水中，然后將用繩系住的瓶蓋提起。
A1.10 土壤標本
在牲畜死亡或宰殺的地點，應取土壤標本以供檢查。
A2 顯微鏡檢查
所有來自病人、病畜或尸體的標本，都應首先進行顯微鏡檢查。
A2.1 復合負染法
將標本或懸液滴在載玻片上，立即加等量的炭素墨水，混勻推片。待干燥后滴加95%乙醇數滴，干燥后再以1%結晶紫液染1min，用水沖洗，干后用油鏡檢查。如果發現在細菌與炭素顆粒之間存在明顯的、連續的間隔帶，即說明細菌的周圍存在莢膜。
液體標本(如血液、腦脊液)和懸液標本(如糞便或混有血液的土壤)在能夠采取標本后立即進行顯微鏡檢查的情況下，推薦使用復合負染法。
A2.2 莢膜染色法
將標本涂片或印片干燥，妥善包裝后帶回實驗室，按常規方法固定，以美藍染液染色3～5min(如莢膜不清晰，染色時間可稍延長)，水洗、干后鏡檢。菌體呈藍色，而莢膜呈紅色。
組織印片標本，或制片后無法立即進行顯微鏡檢查，或進行大面積普查時，推薦使用莢膜染色法。
A2.3 顯微鏡檢查結果判定
來自病人、病畜或尸體的標本中如發現由較寬的莢膜環繞的、兩端平齊的粗大桿菌，特別是鏡下發現大量、純一通常呈竹節狀的該種細菌，而且沒有明顯的其他細菌污染時，炭疽的診斷便可確立。
A3 細菌分離培養
A1 中所列的全部標本，均應進行細菌分離培養。
A3.1 培養基
炭疽芽孢桿菌的分離培養應同時用兩種培養基進行：常規的血瓊脂平板和選擇性平板。后者按如下處方配制：
蛋白胨 2g EDTA 0.03g
氯化鈉 0.5g 乙酸亞鉈 0.004g
醇母浸膏粉 0.5g 水楊素 1g
0.2%溴麝香草酚藍(BTB) 1.2mL 瓊脂粉 1.8g
加蒸餾水至100mL，調pH至7.6，121℃滅菌20min，冷卻至45～50℃時，加入：多粘菌素B(3000u/mL水溶液)0.1mL，溶菌酶(30000u/mL水溶液)0.1mL，混勻后傾注平板。
A3.2 標本處理
在正常情況下應當無菌的標本，如血液或腦脊液，直接涂布上述兩種平板，每平板0.1mL，組織標本應先以無菌剪刀剪開一斷面，在培養基表面壓印，然后以白金耳涂開。
所有污染的和陳舊的標本，均應首先制成懸液。根據標本中含菌量的多少，可將懸液適當稀釋，或經自然沉淀除去粗大沉淀物后，再3000r/min離心30min，取富集的沉淀物。將所得的懸液67℃加熱15min，冷卻后涂布上述兩種平板，每平板0.1mL。
A3.3 挑選可疑菌落
上述平板在37℃孵育過夜或24h后，檢查是否長出可疑的炭疽芽孢桿菌菌落。
炭疽芽孢桿菌在血瓊脂平板上的形態為：灰白色、不透明、中等大小，常不規則，表面呈毛玻璃樣，周圍無溶血環。
炭疽芽孢桿菌在選擇平板上菌落較血瓊脂平板上為小，具有類似表面特征，菌落呈藍綠色。但是，若遇菌落形態與以上描述完全一致但呈黃色的菌落，也應進行A4的鑒定步驟。
A4 炭疽芽孢桿菌鑒定
將上述可疑菌落挑出，劃線接種于普通營養瓊脂平板之上，在劃線區內分別貼上浸有診斷用炭疽芽孢桿菌噬菌體和青霉素的紙片。37C孵育過夜或24h后，在兩種紙片的周圍均出現明顯的抑菌環，便可判定為炭疽芽孢桿菌。在病人、病畜或尸體中分離獲得炭疽芽孢桿菌，炭疽的診斷便可確立。
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