經(jīng)濟(jì)高效的人足月胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)方法
胎盤(pán)是維持胎兒在宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)、發(fā)育的重要器官，下面是小編搜集整理的一篇探究胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)方法的論文范文，供大家閱讀參考。
前言
胎盤(pán)是妊娠期存在的特殊器官，是母體與胎兒之間物質(zhì)交換的場(chǎng)所，是維持胎兒在宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)、發(fā)育的重要器官[1].胎盤(pán)細(xì)胞成分復(fù)雜，其中滋養(yǎng)細(xì)胞在胚胎植入、妊娠維持中扮演著重要角色，其功能調(diào)節(jié)失常與多種妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前滋養(yǎng)細(xì)胞的體外模型主要有原代滋養(yǎng)細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞系兩大類(lèi)，滋養(yǎng)細(xì)胞系操作方便，但是任何一種滋養(yǎng)細(xì)胞系都無(wú)法完全替代原代滋養(yǎng)細(xì)胞。
課題組前期[2-4]已經(jīng)成功培養(yǎng)出早孕期絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞，同時(shí)對(duì)趨化因子在早孕期母胎界面的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制做了一系列的研究。但是早孕期絨毛中提取的細(xì)胞數(shù)量十分有限，若進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)則會(huì)受到細(xì)胞數(shù)量的限制。近年來(lái)有研究[5]認(rèn)為足月胎盤(pán)中富含滋養(yǎng)細(xì)胞，并且這個(gè)時(shí)期的細(xì)胞對(duì)研究滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)的病理妊娠有很大的價(jià)值。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，擬建立一種經(jīng)濟(jì)、高效的人足月胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)方法，為日后研究滋養(yǎng)細(xì)胞及相關(guān)疾病提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1胎盤(pán)組織選取武漢大學(xué)中南醫(yī)院婦產(chǎn)科因社會(huì)因素行剖宮產(chǎn)的健康產(chǎn)婦。產(chǎn)婦年齡為20-35歲，孕周為37-40周，均為單胎妊娠，排除高血壓、心臟病及傳染病史。術(shù)中用無(wú)菌手術(shù)剪剪取臍帶周邊面積為5cm×5cm大小的胎盤(pán)組織，立即放入含雙抗(青霉素0.1g/L,鏈霉素0.1g/L)無(wú)菌PBS中于2h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，4℃保存。標(biāo)本收集經(jīng)武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及孕婦本人知情同意。
1.1.2主要試劑及儀器DMEM/F-12(美國(guó)Hy-clone)，胰蛋白酶粉、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、DNA酶Ⅰ型DN25、細(xì)胞外基質(zhì)膠(extracellularmatrix,ECM膠)、CCK-8試劑盒(美國(guó)Sigma公司);胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)，Percoll細(xì)胞分離液(美國(guó)phamacia公司)，小鼠抗人角蛋白(cytokeratin,CK)-7單克隆抗體、兔抗人波形蛋白(Vimentin)多克隆抗體、免疫組化試劑盒、免疫組化DAB試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)SHELLAB)，倒置顯微鏡(日本Olympus);恒溫?fù)u床、離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)、酶標(biāo)儀、無(wú)菌超凈臺(tái)。
1.2方法
1.2.1原代培養(yǎng)取約40g胎盤(pán)組織，在無(wú)菌操作臺(tái)中用無(wú)菌手術(shù)剪將胎盤(pán)組織分離除去大血管、結(jié)締組織，用無(wú)菌PBS反復(fù)沖洗血污，直至沖洗液接近無(wú)色。將組織盡量剪碎至1-3mm3,并盡可能去除肉眼可見(jiàn)的小血管和纖維連接成分。將剪碎的組織加入終濃度為0.25%胰酶和0.2mg/mlDNAseⅠ組成消化液，分3次消化，消化液總體積分別為150,100,75ml.分別在恒溫?fù)u床中37℃、120r/min消化20min.前兩次的消化液經(jīng)100目網(wǎng)篩過(guò)濾后倒除，剩余組織再進(jìn)行第3次消化，血清終止消化、網(wǎng)篩過(guò)濾后收集消化液，4℃離心1500r/min,15min,離心后棄上清以3mlDMEM/F-12重懸細(xì)胞。
1.2.2細(xì)胞純化---不連續(xù)Percoll密度梯度分離在15ml無(wú)菌離心管中按濃度從大到小逐層鋪入70%,50%,30%,10%4個(gè)密度的Percoll分離液[6],每個(gè)密度鋪3ml.然后將3ml細(xì)胞懸液緩慢加于Percoll分離液上層，4℃水平離心機(jī)下2000r/min離心20min.用吸管小心吸取30%-50%之間云霧狀的細(xì)胞層(滋養(yǎng)細(xì)胞)，放入一支無(wú)菌離心管里，用約4mlDMEM重懸細(xì)胞，室溫下1000r/min離心5min.棄上清后的細(xì)胞沉淀，用含15%胎牛血清的DMEM/F-12重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至1×106ml,種于預(yù)先置有蓋玻片以及鋪好ECM膠的6孔板內(nèi)，5%CO2、37℃的溫箱里培養(yǎng)。
1.2.3細(xì)胞鑒定細(xì)胞培養(yǎng)24h后取出6孔板中細(xì)胞爬片，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定15min.固定細(xì)胞經(jīng)0.1%TritonX-100增加細(xì)胞膜通透性后，按照免疫組化試劑盒進(jìn)行操作。封閉液室溫孵育15min后，PBS洗3遍，分別加入CK-7、Vimen-tin單克隆抗體，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，4℃孵育過(guò)夜。次日依次加入生物素標(biāo)記二抗、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶反應(yīng)試劑，DAB避光顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀(guān)察拍照計(jì)算純度。
1.2.4CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)分離得到的原代滋養(yǎng)細(xì)胞以2×105細(xì)胞/孔種植于96孔板，培養(yǎng)24,48,72,96,120h,每孔加入CCK-8液10μl,37℃繼續(xù)孵育2h后，終止培養(yǎng)，選擇450nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的吸光度值。
2結(jié)果
2.1免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定足月胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞
細(xì)胞爬片染色結(jié)果顯示，CK-7標(biāo)記細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜可見(jiàn)明顯的棕黃色染色，陽(yáng)性表達(dá)的`細(xì)胞大于90%(圖1A);波形蛋白染色與陰性對(duì)照組均表達(dá)陰性(圖1B、1C).
2.2體外培養(yǎng)足月胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)觀(guān)察
每次取材組織量約30-40g,可獲得細(xì)胞數(shù)量大于107個(gè)細(xì)胞。新鮮分離的細(xì)胞為均一的圓形單核細(xì)胞，核大突出，胞質(zhì)豐富(圖2A)。培養(yǎng)3h后開(kāi)始貼壁(圖2B),12h后基本全部貼壁，細(xì)胞呈胖三角形或不規(guī)則多角形和圓形，24h后可見(jiàn)細(xì)胞開(kāi)始融合成具有多個(gè)核的合體滋養(yǎng)細(xì)胞，并隨著時(shí)間推移逐漸融合成片生長(zhǎng)(圖2C)。細(xì)胞不能傳代生長(zhǎng)。
2.3滋養(yǎng)細(xì)胞體外增殖活力
利用CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)原代培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞體外增殖能力，從生長(zhǎng)曲線(xiàn)上看細(xì)胞在體外96h可達(dá)小高峰，但不能成倍增殖，表明細(xì)胞體外增殖能力低下(圖3).【1】
3討論
滋養(yǎng)細(xì)胞是構(gòu)成胎盤(pán)的主要細(xì)胞，在維持妊娠和抵御病原微生物的宮內(nèi)傳播中扮演著重要角色[7].流產(chǎn)、早產(chǎn)、妊娠期高血壓疾病、胎兒生長(zhǎng)受限等多種產(chǎn)科疾病都可能與滋養(yǎng)細(xì)胞的功能異常相關(guān)[8-10],因此建立滋養(yǎng)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型是滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)的病理妊娠機(jī)制研究的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具有十分重要的意義。晚孕期胎盤(pán)絨毛組織中細(xì)胞成分復(fù)雜，滋養(yǎng)細(xì)胞的純化是此研究的關(guān)鍵。胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞的分離方案中，以1986年Kliman等[11]建立的Per-coll連續(xù)密度梯度分離法最為經(jīng)典。其方法為配制14個(gè)不同密度的Percoll細(xì)胞分離液，利用不同細(xì)胞的相對(duì)懸浮密度不同的原理，將胎盤(pán)絨毛中不同成分的細(xì)胞分開(kāi)，可獲得滋養(yǎng)細(xì)胞純度可達(dá)85%,并確定滋養(yǎng)層細(xì)胞在percoll中所處的密度值為1.048-1.062g/L.但該方法操作繁瑣耗時(shí)，稍有不慎極易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。后續(xù)有研究[12,13]將該方法簡(jiǎn)化為35%、45%或者30%、60%兩個(gè)分離梯度，王冬菊等研究[14]表明只用兩個(gè)梯度根本不能將細(xì)胞很好的區(qū)分開(kāi)，其將percoll密度梯度簡(jiǎn)化為10%、30%、50%、70%,細(xì)胞懸液經(jīng)密度梯度離心后，在4個(gè)梯度之間均能形成明顯的分離帶，從上至下分別為細(xì)胞碎片層、滋養(yǎng)細(xì)胞層、胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞層、紅細(xì)胞。并用單標(biāo)法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞純度可達(dá)85%以上。之前的研究均強(qiáng)調(diào)收集三次消化所得的細(xì)胞懸液，但本研究建議舍棄第1次和第2次的消化液，只保留第3次的消化液。前期研究將3次消化的消化液分別經(jīng)過(guò)percoll密度梯度離心后發(fā)現(xiàn)，前兩次主要是細(xì)胞碎片層和紅細(xì)胞層，第3次消化液經(jīng)密度梯度純化后可見(jiàn)明顯的滋養(yǎng)細(xì)胞層，更關(guān)鍵是經(jīng)過(guò)前兩次消化紅細(xì)胞和雜細(xì)胞數(shù)量大大減少，更有利于細(xì)胞計(jì)數(shù)和種板，此操作節(jié)約percoll用量，節(jié)約成本，更有利于純化細(xì)胞。
此外，滋養(yǎng)細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖能力低下，種植于普通培養(yǎng)板時(shí)，不易貼壁生長(zhǎng)。
ECM膠主要是由蛋白聚糖、層黏連蛋白等構(gòu)成，對(duì)細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)和增殖等起到促進(jìn)作用，通過(guò)前期摸索，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)板鋪以一定厚度的ECM膠，有利于滋養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。
原代培養(yǎng)過(guò)程中需注意以下環(huán)節(jié)：
�、偃〔幕颊叩哪挲g越小，組織越新鮮越好，培養(yǎng)時(shí)容易得到活力更好數(shù)量更多的滋養(yǎng)細(xì)胞。
�、跇�(biāo)本應(yīng)置于無(wú)菌等滲液中保持其活性，用冰盒送回實(shí)驗(yàn)室并在2h內(nèi)進(jìn)行處理，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)組織容易失去活性，取回的標(biāo)本應(yīng)用含雙抗的PBS徹底反復(fù)清洗至液體清亮，因紅細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中也會(huì)消耗培養(yǎng)液中養(yǎng)分，容易造成細(xì)胞生長(zhǎng)受限。
�、劢M織盡量剪成漿糊狀，越碎消化越充分，消化液的體積和消化次數(shù)可以根據(jù)組織量調(diào)整，至少消化3次。
�、蹺CM膠盡量鋪薄且均勻，細(xì)胞種板前鋪好膠，并置于溫箱中使其充分干燥。
本研究在前期基礎(chǔ)上進(jìn)一步簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作步驟，一次性可獲得大量且純度較好的胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞，可同時(shí)滿(mǎn)足多種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)細(xì)胞數(shù)量的需求，為日后進(jìn)行滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)疾病的研究提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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