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淺談HPLC法測定復(fù)方靈芝顆粒中五味子甲素的含量
摘要:目的 建立復(fù)方靈芝顆粒中五味子甲素含量測定的方法。方法 用高效液相色譜法測定，色譜條件為：C18柱，(5 μm,250×4.6 mm)，流動相為甲醇水(體積比75∶25)，檢測波長為254 nm。結(jié)果 五味子甲素在0.1608～6.432 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R=09996)，平均加樣回收率為99.27%，RSD=1.02%(n=6)。結(jié)論 該法操作簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，建立的定量方法可用于復(fù)方靈芝顆粒質(zhì)量的控制。
關(guān)鍵詞:HPLC;復(fù)方靈芝顆粒;五味子甲素
Abstract: Objiective To establish a method for the content determination of deoxyschizandrin in complex Lingzhi granule. Methods HPLC was performed on an ODS-C18 column (5μm,250 mm×4.6 mm) using methanolwater (75∶25) as the mobile phase under the detection wavelength of 254 nm. Results The linear range of deoxyschizandrin was 0.1608-6.432μg. The mean recovery was 99.27% with RSD 1.02%(n=6).Conclusion This method is simple,reproducible and accurate for the content determination of deoxyschizandrin in complex Lingzhi granule.
Key words:HPLC;complex Lingzhi granule;deoxyschizandrin
復(fù)方靈芝顆粒具有保護(hù)肝臟降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶和退黃作用，用于急性傳染性黃疸肝炎，遷延性肝炎，慢性肝炎，單項(xiàng)谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高等癥，其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)2冊，該藥由靈芝、柴胡、五味子和郁金4味藥材組成，五味子為方中主藥之一，為了提高及控制復(fù)方靈芝顆粒的質(zhì)量，本文對五味子中的五味子甲素進(jìn)行含量測定，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本方法簡便，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。
1 儀器和試藥
日本島津LC-10AT HPLC儀; N2000色譜工作站。甲醇(色譜純，Merck公司出品);雙蒸餾水(自制)，其他試劑為分析純。五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)對照品購于中國藥品生物制品檢定所(供含量測定用，批號為110764-200107)，復(fù)方靈芝顆粒(自制，批號：20050201、20050202、20050203、 20050204)。
2 方法與結(jié)果 1 色譜條件的選擇
色譜柱:Inertsil (C18,5 μm,250 mm×4.6 mm);檢測波長：254 nm;流動相：甲醇-水(75∶25),流速：1 mL・min-1;進(jìn)樣量10 μL;柱溫：30 ℃。取一定濃度樣品進(jìn)行測定，此條件下所測五味子甲素與樣品中其他組分色譜峰完全分離，色譜峰形對稱而尖銳(拖尾因子T=1.00)，按五味子甲素峰計算，理論板數(shù)不小于2000。 2 陰性對照試驗(yàn)
取處方量以相同工藝制備的陰性對照(缺五味子)，按上述方法測定，結(jié)果為：陰性對照色譜圖中在與五味子甲素對照品色譜圖相對應(yīng)的保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，結(jié)果表明陰性對照(含靈芝、柴胡和郁金三味藥材)用相同制備方法下提取的成分在測定波長處無吸收，故其他成分其他對五味子甲素測定無干擾，見圖1。 3 樣品溶液制備 3.1 對照品溶液的制備
取五味子甲素對照品1005 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解后稀釋至刻度,搖勻，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液(40.2 μg・mL-1)。
2.3.2 供試品溶液的制備
取本品約4 g，研細(xì)，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加氯仿約40 mL，超聲處理30 min，濾過，殘渣加氯仿30 mL，超聲處理30 min，濾過，合并兩次濾液，將容器和濾紙多次洗滌液并入濾液中，揮干,殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。 4 線性關(guān)系考察
精密吸取五味子甲素對照品貯備液 (0.402 mg・mL-1) 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，置5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，分別取上述對照品溶液各10 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測定，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(m)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=1 194 733m+59 047，r=0.999 6。其線性范圍為0.402～6.432 μg，結(jié)果表明在此范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。 5 精密度試驗(yàn)
取上述對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定，其RSD=0.75%(n=6)。 6 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取上述對照品溶液10 μL，分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定，其RSD=0.98%(n=6),表明樣品在12 h以內(nèi)是穩(wěn)定的。 7 重復(fù)性試驗(yàn)
取供試品(批號：20050201)6份，每份約4 g，按“23”項(xiàng)下方法制備并測定，測出五味子甲素平均含量為15.3 mg・g-1，RSD=1.21%(n=6)。 8 加樣回收試驗(yàn)
取已知含量供試品(批號：20050201，含量15.3mg・g-1)，加入定量的五味子甲素對照品溶液，依樣品測定項(xiàng)下的方法測定，計算其回收率=99.27%，RSD=1.02%(n=6)，結(jié)果見表1。表1 回收率測定結(jié)果(略) 9 樣品測定
分別吸取對照品和供試品溶液各10 μL，按上述方法測定供試品中五味子甲素含量，其結(jié)果(n=3)為：批號20050201為15.3 mg・g-1、批號20050202為14.2 mg・g-1、批號20050203為16.5 mg・g-1和批號20050204為13.7 mg・g-1。
3 討 論 1 本品由靈芝、五味子等4味藥材組成，曾經(jīng)對靈芝所含腺苷等成分進(jìn)行測定[1]，但其含量較低(低于0.01%)，干擾嚴(yán)重，不宜作為指標(biāo)成分;結(jié)果選用五味子中的五味子甲素作為定量指標(biāo)，用HPLC法測定其含量，結(jié)果陰性無干擾，且方法穩(wěn)定可靠，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好。 2 測定時應(yīng)注意掌握好樣品前處理，曾經(jīng)采用索氏提取[2]，加熱回流，超聲提取對樣品進(jìn)行處理，結(jié)果以超聲提取兩次較為完全，操作簡單快捷。 3 經(jīng)過比較不同比例的甲醇水(65∶35)、(75∶25)、(85∶15)，乙腈-水-冰醋酸(70:30:0.1)[3]等流動相系統(tǒng)對本品中五味子甲素與雜質(zhì)的分離度與保留時間，發(fā)現(xiàn)流動相甲醇水(75∶25)能保證所測本品與雜峰完全分離(分離度R≥1.5)，色譜峰形對稱而尖銳(拖尾因子 T=1.00)。
參考文獻(xiàn):
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