養(yǎng)肝柔肝中藥對(duì)膽囊膽固醇結(jié)石豚鼠膽囊細(xì)胞鈣離子濃度的影響

養(yǎng)肝柔肝中藥對(duì)膽囊膽固醇結(jié)石豚鼠膽囊細(xì)胞鈣離子濃度的影響

作者：沈平，方邦江，朱培庭，張靜，裴新軍
【摘要】 通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)豚鼠膽囊細(xì)胞鈣離子濃度（［Ca 2 ］i）的變化，探討膽固醇結(jié)石形成與養(yǎng)肝柔肝中藥防治膽結(jié)石的作用機(jī)制。方法:將80只受試豚鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、養(yǎng)肝柔肝中藥組和熊去氧膽酸組，每組20只。后三組采用高膽固醇致石食餌誘發(fā)法建立豚鼠膽結(jié)石動(dòng)物模型，其中養(yǎng)肝柔肝中藥組、熊去氧膽酸組分別給予相應(yīng)藥物進(jìn)行防治實(shí)驗(yàn)，連續(xù)用藥7周后，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)豚鼠大體情況、膽結(jié)石生成情況以及膽囊細(xì)胞［Ca2 ］i的變化進(jìn)行觀察。結(jié)果:模型組動(dòng)物膽囊細(xì)胞［Ca 2 ］i明顯降低，養(yǎng)肝柔肝中藥不僅能明顯改善豚鼠行為學(xué)體征，降低膽結(jié)石的成石率，而且可提高膽囊細(xì)胞［Ca2 ］i。結(jié)論:膽囊細(xì)胞［Ca2 ］i降低是導(dǎo)致膽囊的收縮功能降低，膽固醇結(jié)石形成的重要因素。提高膽囊細(xì)胞［Ca2 ］i，增強(qiáng)膽囊平滑肌細(xì)胞的收縮功能，減輕膽汁淤滯，可能是養(yǎng)肝柔肝中藥防治膽石病的作用機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】 膽固醇
　我國(guó)膽石病呈較快的上升趨勢(shì)，部分地區(qū)患病率已達(dá)10%［1］，接近世界發(fā)達(dá)國(guó)家膽石病10%～15%的發(fā)病水平［2］。膽石病仍是我國(guó)良性膽道疾患中致死、致殘的重要原因。我們的前期研究工作表明，養(yǎng)肝柔肝中藥對(duì)膽石病具有一定的臨床療效［3，4］。本實(shí)驗(yàn)以高膽固醇飲食誘發(fā)豚鼠膽結(jié)石，采用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry， FCM）測(cè)定實(shí)驗(yàn)豚鼠膽囊細(xì)胞鈣離子濃度［Ca2 ］i，以探討?zhàn)B肝柔肝中藥防治膽囊結(jié)石形成的作用機(jī)制。
　　1 材料與方法
　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用白色、紅目豚鼠，雌雄各半，清潔級(jí)，體質(zhì)量（220±20）g，共80只，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　1.2 主要試劑、藥物與儀器
　　1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑和藥物 Fluo-3，AM熒光染料，美國(guó)Molecular Probes公司產(chǎn)品;養(yǎng)肝柔肝中藥采用養(yǎng)肝利膽顆粒（何首烏、枸杞子、白芍藥、陳皮、甘草），8 g/包，每克相當(dāng)于含原藥材4.5 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院制劑室提供;熊去氧膽酸 （ursodeoxycholic acid， UDCA），上海三維長(zhǎng)江生化制藥廠產(chǎn)品，批號(hào)為200304005，10 mg/片。
　　1.2.2 主要儀器 Mgna FTIR-750型紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Nicolet公司產(chǎn)品;LG-10低溫高速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品;Facscalibour流式細(xì)胞儀，美國(guó)Becton Dickinson公司產(chǎn)品。
　　1.3 動(dòng)物分組、造模及藥物處理 所有豚鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物室，室溫（23±10）℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，無(wú)懷孕及不良反應(yīng)，飲食、飲水正常者，即納入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)豚鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、熊去氧膽酸組和養(yǎng)肝柔肝中藥組，每組各20只。采用高膽固醇致石食餌誘發(fā)法建立豚鼠膽囊膽固醇結(jié)石動(dòng)物模型［5］，正常對(duì)照組喂正常飼料及青菜適量，模型組喂以致石飼料及少量青菜，各治療組在喂以相當(dāng)于模型組的致石飼料及青菜的同時(shí)給以藥物灌胃。藥物以成人用藥劑量（ 60 kg 體質(zhì)量，養(yǎng)肝利膽顆粒18 g/d、UDCA 300 mg/d） 按體型系數(shù)換算［6］，養(yǎng)肝柔肝中藥組給以養(yǎng)肝利膽顆粒1.81 g/（kg·d），熊去氧膽酸組給以UDCA 30.12 mg/（kg·d），模型組和正常對(duì)照組豚鼠灌胃等容量的生理鹽水，連續(xù)7周。
　　1.4 標(biāo)本采集與處理
　　1.4.1 標(biāo)本采集 各組動(dòng)物均于第7周末取材。 以15%烏拉坦腹腔注射麻醉，活體下肉眼觀察膽汁中成石情況，然后完整切除膽囊后，再仔細(xì)觀察膽囊內(nèi)成石情況，收集膽石。完整切除膽囊后冷凍保存標(biāo)本。
　　1.4.2 標(biāo)本處理 取豚鼠膽囊修剪成米粒大小，用醫(yī)用剪刀剪碎，同時(shí)不斷用PBS沖洗，獲得細(xì)胞懸液后用40 μm的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，再用PBS沖洗兩遍， 1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至每管106個(gè)細(xì)胞，分別加入A、B管中，在A管中加入PBS，B管中加入Fluo-3熒光素，混勻后放在暗處，室溫下靜止45 min，PBS沖洗一遍上機(jī)待測(cè)。
　　1.5 膽石紅外光譜定性 采用溴化鉀壓片法測(cè)定膽結(jié)石樣品。
　　1.6 膽囊細(xì)胞［Ca2 ］i的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［7］，使用Facscalibour流式細(xì)胞儀檢測(cè)，利用CELL-Quelt功能軟件進(jìn)行參數(shù)的獲取和數(shù)據(jù)分析。
　　1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料用 x ±s 表示，組間均數(shù)比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料采用率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)方法。所有運(yùn)算程序均在計(jì)算機(jī)上運(yùn)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行。
　　2 結(jié)果
　　2.1 豚鼠大體情況 正常對(duì)照組豚鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量自然增加，反應(yīng)靈活，活動(dòng)敏捷，被毛密集而有光澤、緊貼皮膚，鼻、唇濕潤(rùn)清潔，眼睛明亮，大便正常，在飼養(yǎng)過(guò)程中無(wú)死亡。模型組動(dòng)物表現(xiàn)飲食減少，生長(zhǎng)緩慢，被毛干枯、蓬松且易脫落，活動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍，眼睛、鼻、唇、耳、尾部色淡少澤。熊去氧膽酸組和養(yǎng)肝柔肝中藥組豚鼠行為學(xué)表現(xiàn)、體質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)狀況等方面與模型組比較有明顯改善，但不能恢復(fù)到正常對(duì)照組水平。模型組豚鼠在造模30 d后有3只動(dòng)物死亡，經(jīng)解剖膽囊發(fā)現(xiàn)有2只豚鼠膽囊發(fā)生結(jié)石。養(yǎng)肝柔肝中藥組、熊去氧膽酸組各有 2只 動(dòng)物死亡，這兩組死亡豚鼠經(jīng)解剖膽囊均未發(fā)現(xiàn)明顯結(jié)石生成。由于上述三組共計(jì)7只豚鼠死時(shí)未達(dá)造模的時(shí)間要求，所以沒(méi)有計(jì)入成石率的結(jié)果，也未作為標(biāo)本采集的來(lái)源。
　　2.2 膽石定性 肉眼所見(jiàn)膽囊結(jié)石呈膽石泥砂或絮狀沉淀。經(jīng)紅外光譜檢測(cè)分析為膽固醇結(jié)石。
　　2.3 豚鼠膽囊結(jié)石生成情況 以肉眼觀察可見(jiàn)膽囊內(nèi)有塊狀及絮狀沉淀物并經(jīng)紅外光譜鑒定為膽固醇結(jié)石。正常對(duì)照組中1只動(dòng)物無(wú)膽囊而沒(méi)有計(jì)入成石率的統(tǒng)計(jì)，其余19只動(dòng)物中有1只發(fā)生膽石，成石率為5.26%。模型組動(dòng)物中除3只死亡外，其余17只動(dòng)物中有14只出現(xiàn)膽石，成石率為 82.35% ，明顯高于正常對(duì)照組（ P

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