探析HCV檢測現狀及新進展

探析HCV檢測現狀及新進展

摘要： 丙肝是嚴重威脅人類健康的傳染病之一，主要通過血液傳染。我國平均感染率為3.2%。北方稍高，約為4.6%，南方為2.6%～2.9%，感染人數估計有3700萬。受感染的母親傳播給嬰兒的發生率為5%。患急性肝炎后約有50%～70%的感染者有轉為慢性肝炎的傾向，重者20～25年后可轉化為肝硬化，肝硬化患者10年內有大約30%的發展為終末期肝病[1-2]，并且HCV感染與原發性肝細胞癌有較密切的關系。對于HCV感染者，第3、5、7、10年的肝癌累積發生率達11%、18.1%、29%、45.6% [3]。隨著醫學檢驗的迅猛發展，HCV檢測技術也不斷提高．但與檢測乙型肝炎病毒（HBV）相比，HCV的檢測還有許多難題有待解決。

關鍵詞： HCV 抗–HCV RNA ELISA RT-PCR

HCV檢測目前存在的主要問題有：1.由于HCV抗原結構的特殊性，直接檢測血清中HCV抗原的技術問題還未徹底解決。2.抗體（抗－HCV）出現時間晚，從HCV感染后到抗體轉陽的時間平均為50～70天，有的患者可延長至6～9個月，檢測的“窗口期”較長。3.病毒基因型復雜而且容易變異，使基因水平的檢測質量不夠穩定。隨著有關人員近年來的不斷努力和相關科學的迅猛發展，已經在HCV檢測技術方面有了重要進展。
1 第三代抗－HCV試劑的應用
檢測丙型肝炎病毒抗體（抗HCV）仍是目前常用手段，這方面的檢測方法主要是第三代酶免疫測定法（EIA）或間接酶免疫法（ELISA），我國大多采用ELISA方法。
ELISA方法中包被抗原的組成和質量是關鍵因素。第三代ELISA試劑比第一、第二代試劑有明顯的改進，其包被的抗原為HCV核心抗原NS3、NS4和NS5。由于第一、第二代試劑的重組基因多肽抗原中仍有SOD多肽，所以都存在抗－SOD造成的假陽性。而第三代HCV試劑，用中國北方地區HCV全基因序列，根據文獻開發的預測蛋白理化性質及三級結構和抗原決定簇的位點的序列軟件，完成了HCV全基因序列的親水性﹑親近性﹑移動性分析，已預測到HCV抗原決定簇的位點。第三代試劑的特異性達到99%[4]�？梗璈CV檢測可成為丙型肝炎病毒早期感染的檢測指標[5]。
HCV感染通常是持續的終生感染。雖然第三代HCV抗體ELISA試劑增加了HCV Ns5區表達的蛋白作為抗原，提高了試劑敏感性，HCV感染的“窗口期”通常還需要平均40多天。因此，第三代ELISA試劑仍需要提高和改進，例如在篩查試驗的特異性方面，仍存在假陽性結果。對強陽性或弱陽性樣本的檢測，國產試劑（主要廠家）的s/co值高于進口試劑，但是無論對陽性及陰性樣本檢測，國產試劑的CV值及特異性均明顯低于進口試劑，以致出現更多的假陽性結果。此外，丙肝抗體酶免試劑皆沒有灰區的設定，s/co比值較低（但大于１）的結果也報告陽性，亦是假陽性比較多的原因。[6]
2 丙型肝炎病毒抗原檢測方法的建立
多年來，專業人員一直探索能夠直接檢測HCV抗原，以達到縮短窗口期的目的。但是由于HCV抗原的特殊性和相關抗體制備中存在的困難，使這方面的進展受到阻礙。
2.1 HCV核心抗原檢測
HCV核心抗原是HCV感染者體內出現的早期感染指標，幾乎與HCV RNA同時出現，核心抗原和HCV RNA的動力學變化密切相關。
HCV核心抗原檢測用雙抗體夾心法定性或定量檢測血清樣品中的HCV核心抗原，其基本原理是：以基因工程核心抗原免疫小鼠后獲得的純抗HCV核心抗原單克隆抗體作為固相包被物，用與固相包被物有不同抗原決定簇的抗-HCV核心抗原單克隆抗體作為辣根過氧化物酶標記物，與血清中的HCV核心抗原反應，OPD顯色后進行定性或定量測定。該方法不受被檢測樣品中抗-HCV的干擾，檢測結果準確可靠�？捎糜贖CV早期急性丙型肝炎診斷，抗-HCV陽性感染者的病毒血癥分析以及HCV感染者治療前后病毒血癥追蹤分析[7]。
有報道，HCV-CAg檢測可以較HCV抗體檢出時間提早23～46d[8]，且EIA法較PCR法簡便、快速，現有能力開展ELISA檢測的實驗室無需增加特殊設備，均可檢測。其結果與RT-PCR方法的復合率為85.71%。因此，在不具備RNA檢測條件的實驗室開展HCV-CAg檢測時很好的篩查方法。有報道，在對180例抗-HCV陰性患者的篩查中，檢出HCV－CAg陽性2例，表明僅用抗－HCV檢測將有可能存在0.55%感染者漏診的風險，尤其是對手術前丙肝病毒篩查的病例，它涉及到術中感染責任和用血安全等問題。丙肝核心抗原檢測在一定程度上降低了這些風險。因此,丙肝核心抗原檢測可作為HCV抗體檢測的補充試劑。

2.2 HCV抗原檢測
十幾年來，一些學者曾經試圖建立血清中各種HCV抗原的檢測方法，但由于血液中HCV抗原含量太低，用常規方法無法檢測出。近年來，由于HCV單克隆抗體的研究成功，已有國內外學者發表了肝組織及人體分泌物中HCV抗原檢測成功的報導。如果能加強對HCV中和抗體Wv、抗-HCV-IgM、抗-HCV核心抗體的研究[9]，進一步開發對血清及肝組織內HCV抗原的測定，可能會在丙肝的實驗診斷方面取得更大進展。
3 丙型肝炎病毒RNA的檢測
現在用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測血清中的HCV RNA�；�本原理是首先經逆轉錄酶作用，在特異性

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