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鼠源抗柑橘潰瘍病菌Fab抗體庫(kù)的構(gòu)建
1 引言
柑桔潰瘍病是由地毯草黃單胞桿菌柑桔致病變種( Xanthomonas axonopodis pv. citri) 引起的一種國(guó)內(nèi)外重大檢疫性病害，給世界柑桔產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失。病菌主要隨罹病種苗等繁殖材料遠(yuǎn)距離傳播，生產(chǎn)上常用的銅基殺菌劑和抗生素制劑對(duì)其防效不佳[1]，探索柑桔潰瘍病的防治新途徑在目前和將來(lái)都具有重大意義�；蚬こ讨亟M單抗兼具治療和診斷雙重功能，利用抗原-抗體特異性結(jié)合原理，可用于人類(lèi)疾病、植物病害的診斷、治療和預(yù)防。
近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)使人們可以繞開(kāi)細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，直接從基因水平制備特異性單鏈抗體，由此開(kāi)創(chuàng)了簡(jiǎn)便、快速生產(chǎn)基因工程抗體的先河，被認(rèn)為是繼雜交瘤技術(shù)后抗體生產(chǎn)技術(shù)的又一次革命[2,3]。20 世紀(jì)80 年代中期，Smith[4] 等提出了噬菌體展示技術(shù)，到90 年代初，Winter 等在前人的研究基礎(chǔ)上創(chuàng)建了噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，將噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用到抗體工程領(lǐng)域，徹底改變了制備抗體的傳統(tǒng)途徑，使抗體技術(shù)進(jìn)入到了基因工程抗體時(shí)代。近年來(lái)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究及疾病診斷方面，但應(yīng)用在植物病害方面研究的報(bào)道卻寥寥無(wú)幾[5,6]。Fab 抗體是由抗體輕鏈片段及重鏈的Fd 段組成的，與單鏈抗體ScFv 相比，具有穩(wěn)定性更好的特點(diǎn)，且可直接在大腸桿菌中表達(dá)有活性的抗體，制備簡(jiǎn)單，省去了復(fù)性等繁瑣的步驟。本研究采用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，以經(jīng)過(guò)多次免疫的小鼠脾細(xì)胞mRNA 為基礎(chǔ)，擴(kuò)增出抗體輕鏈及重鏈Fd 段分別連接到噬粒載體中構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)，為后面的研究奠定基礎(chǔ)。
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
6～8 周齡BALB/c 小鼠4 只，均購(gòu)自第三軍醫(yī)大。
2.1.2 菌株及載體
噬粒 pComb3XSS 由美國(guó)Barbas 實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；Top10 F’、輔助噬菌體VCSM13 為本中心保存；大腸桿菌(Escherichia coli)XL1-Blue 由重慶工學(xué)院饋贈(zèng)。
2.1.3 試劑及耗材
TRIZOL 購(gòu)自Invitrogen 公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega 公司；限制性?xún)?nèi)切酶SacⅠ、XbaⅠ、SpeⅠ、XhoⅠ及T4 DNA 連接酶均購(gòu)自NEB 公司；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
2.1.4 引物
參照美國(guó) Scipps 研究所鼠源抗體庫(kù)構(gòu)建的引物及《實(shí)用分子生物學(xué)操作指南》[7]設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，由上海生工合成。
2.2 方法
2.2.1 動(dòng)物免疫
將柑桔潰瘍菌用生理鹽水稀釋至 1×108CFU/ml，取0.5 ml 腹腔注射6～8 周齡BALB/c小鼠，每周免疫一次，免疫4 周后用ELISA 法測(cè)血清效價(jià)，加強(qiáng)免疫3 天后取脾，并用無(wú)菌注射器針柄在200 目的不銹鋼濾網(wǎng)中將脾臟分離成單個(gè)細(xì)胞，加入Eppendorf 中，離心去上清，用液氮速凍后70℃保存。
2.2.2 提取RNA 及cDNA 第一鏈擴(kuò)增
按照 Trizol 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取小鼠脾臟RNA，通過(guò)凝膠電泳及測(cè)OD 值確定RNA 的質(zhì)量。以O(shè)ligo-dT 為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。
2.2.3 PCR 擴(kuò)增輕鏈及重鏈Fd 段基因
通過(guò)溫度梯度摸索 PCR 反應(yīng)條件為94℃ 50s，57℃ 50s，72℃ 10min，35 個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物在1.5 %瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證, 采用凝膠DNA 回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物。
2.2.4 鼠源抗柑橘潰瘍病菌Fab 抗體庫(kù)的構(gòu)建
將 κ 鏈基因 PCR 產(chǎn)物與 pComb3xss 分別用 SacⅠ/XbaⅠ消化，經(jīng)瓊脂糖電泳分離并純化回收, 取1.0 μg 載體片段與0.2 μg κ 鏈片段在80 μL T4 DNA 連接酶反應(yīng)體系中進(jìn)行連接反應(yīng), 經(jīng)沉淀回收后電擊轉(zhuǎn)化XL1- Blue 感受態(tài)細(xì)菌, 加入2 mL SOC，37℃、250rpm 培養(yǎng)1 h 后取少量鋪盤(pán)測(cè)定, 其余加入100 mL 含50 μg /mL 氨芐青霉素和10 μg/mL 四環(huán)素的 SB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒, 得到輕鏈庫(kù)。再分別將輕鏈庫(kù)與Fd 段用 SpeⅠ/XhoⅠ酶切后回收，按前法進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、細(xì)菌擴(kuò)增及轉(zhuǎn)化子測(cè)定。在加入100mL SB 培養(yǎng)液1 h 后加入1 mL 約1012 pfu 的輔助噬菌體 VCSM 13，再培養(yǎng)2 h 后，加卡那霉素至70 μg/mL，37 ℃振蕩過(guò)夜。次日離心收集上清, 加 PEG8000 至4%、NaCl 至3%,冰浴30min，4℃、9 000 r /min 離心20 min, 棄上清, 用2 mL 1%的BSA- PBS 溶解沉淀, 12000 r /min 離心5 min, 棄去不溶性沉淀, 所得上清即為 Fab 噬菌體抗體庫(kù)。
2.2.5 陽(yáng)性克隆的菌落PCR 鑒定及酶切鑒定
分別挑取 10 個(gè)輕鏈庫(kù)及 Fab 庫(kù)陽(yáng)性克隆，經(jīng) PCR 初步鑒定后再分別用 SacⅠ/XbaⅠ及 SpeⅠ/XhoⅠ 雙酶切鑒定其重組率。
3. 結(jié)果與分析
3.1 總RNA 的提取
對(duì)提取的總RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其中總RNA 電泳條帶以28S rRNA 和18SrRNA 為主，用分光光度計(jì)測(cè)得總RNA 的OD260 / OD280 的比值為1. 8，濃度約為1μg/μL，顯示總RNA 質(zhì)量好，無(wú)降解，符合試驗(yàn)的要求。
3.2 輕鏈和重鏈Fd 段基因的擴(kuò)增
以 cDNA 第一鏈為模板，分別以輕鏈和重鏈Fd 段基因的3′端引物和5′端引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，分別擴(kuò)增出輕鏈和Fd 段。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，顯示在約680 bp 處可見(jiàn)明顯的擴(kuò)增條帶(如圖2)，與理論值相符。M 為DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)MarkerⅡ, 1-7 分別為輕鏈基因的PCR 產(chǎn)物，8-10 分別為重鏈基因的PCR 產(chǎn)物。
3.3 輕鏈基因庫(kù)的構(gòu)建
1μL 輕鏈重組噬粒的轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌液鋪板克隆數(shù)為 1009 個(gè)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率為1×106，通過(guò)菌落PCR 法鑒定輕鏈重組質(zhì)粒，電泳結(jié)果顯示 10 個(gè)克隆在680 bp 處都有條帶，均判定為陽(yáng)性克隆，用SacI 和XbaI 對(duì)重組噬粒進(jìn)行酶切反應(yīng)再次驗(yàn)證，酶切后產(chǎn)物電泳發(fā)現(xiàn)10 個(gè)克隆均有約4 kb + 680 bp 兩個(gè)條帶，判定為陽(yáng)性克隆(如圖3)，由此計(jì)算重組率約為100%。
3.4 噬菌體Fab 抗體庫(kù)的構(gòu)建
1μL 含抗體Fab 片段基因的重組噬粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌液鋪板有2006 個(gè)克隆子，計(jì)算出轉(zhuǎn)化率約為2×106。隨機(jī)挑取10 個(gè)轉(zhuǎn)化后的克隆子，通過(guò)菌落PCR 法鑒定，其中有8 個(gè)菌落擴(kuò)增出680 bp 的片段，判定為陽(yáng)性克隆，用XhoI 和SpeI 對(duì)重組噬粒進(jìn)行酶切反應(yīng)再次驗(yàn)證，酶切后產(chǎn)物電泳發(fā)現(xiàn)8 個(gè)陽(yáng)性克隆均切出4 kb + 680 bp 兩個(gè)條帶，判定為陽(yáng)性克�。ㄈ鐖D 4），由此計(jì)算重組率約為80%，庫(kù)容量為1.6 ×106。經(jīng)過(guò)輔助噬菌體VCSM13 的超感染，在PEG 沉淀濃縮后，得到的上清即是噬菌體抗體庫(kù)，測(cè)得噬菌體抗體庫(kù)滴度為2.4×1011 cfu。
4 討論
隨著基因工程的不斷發(fā)展，一些小分子抗體在疾病的診斷治療方面越來(lái)越受到重視。但是在植物病害方面的應(yīng)用卻比較少，目前本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)得到了抗柑桔潰瘍病菌親和力較高的ScFv抗體[8]，但由于其穩(wěn)定性不夠，影響了實(shí)際應(yīng)用，相比之下Fab抗體彌補(bǔ)了這一不足[9]。
在本研究中采用柑桔潰瘍病菌免疫的小鼠為建庫(kù)源，從理論上來(lái)說(shuō)，已包含抗柑桔潰瘍病菌的各種抗體基因，而且在構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)時(shí)，抗體重鏈基因和輕鏈基因之間的隨機(jī)組合進(jìn)一步豐富了抗體對(duì)抗原識(shí)別的多樣性。 有研究表明，107個(gè)特異性抗體分子就能識(shí)別全部抗原決定簇的99%， 構(gòu)建一個(gè)庫(kù)容為108 的組合噬菌體抗體庫(kù)，一般可以認(rèn)為基本上包括了所有的抗體分子。目前所構(gòu)建的各類(lèi)抗體庫(kù)，庫(kù)容一般介于106-108[10]，我們構(gòu)建的抗體庫(kù)，庫(kù)容為1.6×106，滴度為2.4×1011 cfu，基本達(dá)到建庫(kù)要求，能滿(mǎn)足多樣性的要求[11]。在以pComb3XSS為載體的噬菌體展示系統(tǒng)中，克隆位點(diǎn)下游含有有一個(gè)能夠編碼6個(gè)組氨酸的His-tag 序列，該序列可作為蛋白標(biāo)簽來(lái)進(jìn)行目的蛋白的檢測(cè)和純化，還含有一個(gè)琥珀終止子，在非琥珀抑制型的大腸桿菌中只表達(dá)目的蛋白，為后期的純化工作帶來(lái)方便。
構(gòu)建過(guò)程中的諸多環(huán)節(jié)都可影響抗體庫(kù)的質(zhì)量，載體的轉(zhuǎn)化效率是制約抗體庫(kù)容量和豐富性的重要因素之一。一般研究中都采用電穿孔法將重組DNA轉(zhuǎn)入宿主菌， 其轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá)109-1010轉(zhuǎn)化子/μg DNA，但是如果在培養(yǎng)液中使用抗生素，電穿孔的轉(zhuǎn)化效率會(huì)顯著降低3-5個(gè)數(shù)量級(jí)。本研究中我們制備了超級(jí)感受態(tài)進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化，運(yùn)用該方法一般情況下可以獲得2×108或者更高的轉(zhuǎn)化效率，比常規(guī)的CaCl2轉(zhuǎn)化法要高出2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。在我們的實(shí)際應(yīng)用兩次轉(zhuǎn)化中獲得了106-107的較好轉(zhuǎn)化效率，且轉(zhuǎn)化的結(jié)果比較穩(wěn)定�？贵w基因的擴(kuò)增是影響庫(kù)容量的另一個(gè)重要因素，其中輕鏈比較容易擴(kuò)增，在56-58℃均可擴(kuò)增出比較亮的目的條帶，但是重鏈Fd段的擴(kuò)增相對(duì)困難一些，而且產(chǎn)率也沒(méi)有輕鏈基因的高，這可能與重鏈基因相對(duì)復(fù)雜有著重要關(guān)系。在克隆過(guò)程中，為盡量減少對(duì)重鏈基因的操作，增加抗體庫(kù)的多樣性，采用先連接輕鏈基因，后連接重鏈Fd段。
5 結(jié)論
本研究成功構(gòu)建了滴度為2.4×1011 cfu 的鼠源抗柑桔潰瘍病菌噬菌體Fab 抗體庫(kù)，為進(jìn)一步研究柑桔潰瘍病的防治工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
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