RPHPLC法測定阿魏酸衍生物的含量測定的方法論文
阿魏酸衍生物（BL）是對阿魏酸（Ferulic Acid，4-羥基-3-甲氧基肉桂酸）苯環進行改造后的化合物，是一個良好的抗氧化劑[1]。文獻[2]報道其清除自由基的能力比阿魏酸明顯增強。BL結構中溴原子的引入[2]，不僅提高了清除自由基的能力，還明顯增大了脂溶性，這有利于其在生物體內的轉運與吸收。本文參照文獻[3-6]建立了反相高效液相色譜方法，用于測定BL含量及其有關物質，為其質量的可控奠定基礎。
1 儀器與試劑
Waters 600-717-996高效液相色譜儀（二元泵，二極管陣列檢測器，自動進樣器，Millennium32色譜工作站）；電子分析天平（Sartorius，BP211D）；KQ3200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；甲醇（色譜純，禹王試劑）；乙酸（分析純，國藥集團）；水（娃哈哈純凈水）；30%H2O2（分析純，國藥集團）；鹽酸（分析純，國藥集團）；氫氧化鈉（純度：96.0%，西隴化工有限公司）；BL對照品（批號：20121101純度：99.91%，由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所提供）；BL供試品（由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所提供，批號分別為20130201，20130202，20130203）。
2 色譜條件與系統適用性試驗
采用Agilent Eclipse C18（250mm×4.6mm，5?m）色譜柱；流動相：甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V）；紫外檢測器檢測波長228nm；流速1.0mL·min-1；進樣量20?L；柱溫：40℃。理論塔板數以BL計算不低于5000，分離度大于1.5，色譜圖見圖1（主峰保留時間：14.5min，雜質1保留時間：5.8min，雜質2保留時間：12.8min，雜質3保留時間：38.8min）。
3 溶液的配制
3.1 對照品溶液
取BL對照品約10mg，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲助溶，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。
3.2 供試品溶液
取BL供試品約10mg，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲助溶，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
4 方法專屬性考察
分別精密稱取BL供試品約20mg，置3個25mL棕色量瓶中，加甲醇適量，超聲助溶，進行如下破壞試驗：①酸破壞：加1mol·L-1鹽酸1mL，室溫下靜置17h，用1mol·L-1氫氧化鈉中和，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；②堿破壞：加1mol·L-1氫氧化鈉4mL，室溫下靜置65h，85℃水浴2.5h，冷卻至室溫，用1mol·L-1鹽酸中和，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；③氧化破壞：加30%雙氧水8mL，室溫下靜置62h，85℃水浴2.5h，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。
按照“2”項下的'色譜條件，分別取各破壞溶液20?L進樣，記錄色譜圖，見圖2。 通過破壞試驗可以看出BL 在堿、氧化條件下比較穩定，放置期間有關物質略有增加，在酸性條件下極不穩定，有關物質增加明顯，但有關物質均與主峰分離良好，不干擾樣品測定，說明該方法專屬性好。
5 方法學考察
5.1 線性關系考察
精密稱取BL對照品（批號：20121101）約4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg分別置于50mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲助溶并稀釋成約0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL、0.28mg/mL、0.32mg/mL的梯度對照品溶液。分別取上述溶液20?L進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積A對濃度C（mg·mL-1）進行線性回歸，得回歸方程 A=84486C-327332（r = 0.9996），表明BL在0.08～0.32mg·mL-1濃度范圍內呈良好線性關系。
5.2 儀器精密度試驗
取濃度為0.20mg/mL對照品溶液，連續進樣6次，每次20?L，以峰面積計算，所得RSD為0.57%（n=6），表明測定時的儀器精密度良好。
5.3 重復性試驗
取同一批號的BL供試品按“3.2”項下方法操作，配制成0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL的低、中、高3個濃度的標準溶液，每個濃度平行配制3份，共9份，照“2”項下色譜條件測定，按外標法以峰面積計算樣品含量，測得平均含量為100.35%，RSD為0.50%（n=9），表明方法重復性良好。
5.4 穩定性試驗
取室溫下放置的低、中、高3個濃度的供試品溶液，各取20?L在0，4，6，8，10，12h的條件下，按照“2”項下色譜條件測定峰面積，測得RSD分別為1.7%、1.4%、1.3%，表明供試品溶液在12h內穩定。
5.5 檢測限與定量限
精密吸取“3.1”項下對照品溶液，加甲醇逐級稀釋，進樣，記錄色譜圖，在信噪比（S/N）為3：1時測得檢測限為8ng，在信噪比（S/N）為10：1時測得的定量限為36ng。
6 樣品含量測定
按“3”項下的方法分別制備對照品溶液和供試品溶液，各取20?L進樣，按外標法以峰面積計算樣品含量，結果表明，3批樣品含量均在99.0%以上（見表1）。
7 有關物質測定
取BL供試品約20mg，精密稱定，置25mL棕色量瓶中，加甲醇適量，超聲助溶，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得0.80mg/mL的溶液作為供試品溶液。精密移取此溶液適量，用甲醇稀釋100倍，得自身對照溶液。以不加校正因子主成分自身對照法計算有關物質的含量[7]。結果表明，有關物質均在1%以內（見表1）。
8 討論
8.1 波長的選擇
取BL對照品溶液進行紫外掃描顯示其最大吸收波長在228nm和317nm處，其中228nm處的吸收值最高，因此選擇228nm用于BL的含量測定，保證測定時有較高的靈敏度。
8.2 柱溫的選擇
考察了25℃、30℃、40℃的不同柱溫下對樣品分離效果的影響，實驗表明，采用40℃的柱溫，可減小流動相粘度、降低柱壓、縮短出峰時間并改善分離效果，故將柱溫定為40℃。
8.3 流動相的選擇
根據BL的化學性質，考慮采用酸性流動相可以獲得較好效果。經過實驗比較采用甲醇-乙酸-水系統作為流動相，并且變換流動相比例和乙酸濃度，最終確定流動相為甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V），此條件下分離效果最好，保留時間適中。
8.4 穩定性考察
由于BL的結構特性，通常在溶液中不穩定，且見光易分解[8-9]，考察了BL溶液在透明量瓶和棕色量瓶中的穩定性，發現BL溶液在透明量瓶放置8小時后含量顯著降低，而在棕色量瓶中的放置12小時含量變化不大，RSD小于2.0%，但是隨著時間增長含量仍會緩慢降低。故在試驗過程中需采取避光措施，并于配制后盡快使用。
8.5 結論
綜上所述，本方法操作簡便且檢測限、定量限、精密度、重復性等均符合要求，故本法適用于對BL含量及其有關物質進行測定，對于BL的質量控制和使用安全有著十分重要的意義。
參 考 文 獻
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[2] 黃華永，張魯勉，鄭錦鴻.5-溴阿魏酸的合成及其清除自由基研究 [J].汕頭大學醫學院學報，2005，18（3） ： 129-131.
[3] 李全斌，何開勇，吳建萍.阿魏酸含量測定方法研究進展[J].中醫藥導報，2011，17（3）： 117-119.
[4] 黃羅生，郭健新，劉詠梅，等.HPLC測定阿魏酸含量的探討[J].中成藥，2004，26（2）： 134-136.
[5] 何玲玲.高效液相色譜法測定當歸養血丸中阿魏酸含量[J].中國醫藥導報，2011，8（3）： 60-62.
[6] 顧民，張亮，張正行.HPLC測定逍遙散及當歸中阿魏酸的含量[J].中成藥，2000，22（5）： 342-344.
[7] ChP（中國藥典）.2010.VolⅡ（二部）：Appendix （附錄）V D
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