RPHPLC法測(cè)定阿魏酸衍生物的含量測(cè)定的方法論文
阿魏酸衍生物（BL）是對(duì)阿魏酸（Ferulic Acid，4-羥基-3-甲氧基肉桂酸）苯環(huán)進(jìn)行改造后的化合物，是一個(gè)良好的抗氧化劑[1]。文獻(xiàn)[2]報(bào)道其清除自由基的能力比阿魏酸明顯增強(qiáng)。BL結(jié)構(gòu)中溴原子的引入[2]，不僅提高了清除自由基的能力，還明顯增大了脂溶性，這有利于其在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收。本文參照文獻(xiàn)[3-6]建立了反相高效液相色譜方法，用于測(cè)定BL含量及其有關(guān)物質(zhì)，為其質(zhì)量的可控奠定基礎(chǔ)。
1 儀器與試劑
Waters 600-717-996高效液相色譜儀（二元泵，二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，Millennium32色譜工作站）；電子分析天平（Sartorius，BP211D）；KQ3200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；甲醇（色譜純，禹王試劑）；乙酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；水（娃哈哈純凈水）；30%H2O2（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；鹽酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；氫氧化鈉（純度：96.0%，西隴化工有限公司）；BL對(duì)照品（批號(hào)：20121101純度：99.91%，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供）；BL供試品（由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供，批號(hào)分別為20130201，20130202，20130203）。
2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
采用Agilent Eclipse C18（250mm×4.6mm，5?m）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V）；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)228nm；流速1.0mL·min-1；進(jìn)樣量20?L；柱溫：40℃。理論塔板數(shù)以BL計(jì)算不低于5000，分離度大于1.5，色譜圖見圖1（主峰保留時(shí)間：14.5min，雜質(zhì)1保留時(shí)間：5.8min，雜質(zhì)2保留時(shí)間：12.8min，雜質(zhì)3保留時(shí)間：38.8min）。
3 溶液的配制
3.1 對(duì)照品溶液
取BL對(duì)照品約10mg，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲助溶，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。
3.2 供試品溶液
取BL供試品約10mg，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲助溶，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
4 方法專屬性考察
分別精密稱取BL供試品約20mg，置3個(gè)25mL棕色量瓶中，加甲醇適量，超聲助溶，進(jìn)行如下破壞試驗(yàn)：①酸破壞：加1mol·L-1鹽酸1mL，室溫下靜置17h，用1mol·L-1氫氧化鈉中和，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；②堿破壞：加1mol·L-1氫氧化鈉4mL，室溫下靜置65h，85℃水浴2.5h，冷卻至室溫，用1mol·L-1鹽酸中和，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；③氧化破壞：加30%雙氧水8mL，室溫下靜置62h，85℃水浴2.5h，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。
按照“2”項(xiàng)下的'色譜條件，分別取各破壞溶液20?L進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖2。 通過(guò)破壞試驗(yàn)可以看出BL 在堿、氧化條件下比較穩(wěn)定，放置期間有關(guān)物質(zhì)略有增加，在酸性條件下極不穩(wěn)定，有關(guān)物質(zhì)增加明顯，但有關(guān)物質(zhì)均與主峰分離良好，不干擾樣品測(cè)定，說(shuō)明該方法專屬性好。
5 方法學(xué)考察
5.1 線性關(guān)系考察
精密稱取BL對(duì)照品（批號(hào)：20121101）約4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg分別置于50mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲助溶并稀釋成約0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL、0.28mg/mL、0.32mg/mL的梯度對(duì)照品溶液。分別取上述溶液20?L進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以峰面積A對(duì)濃度C（mg·mL-1）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=84486C-327332（r = 0.9996），表明BL在0.08～0.32mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。
5.2 儀器精密度試驗(yàn)
取濃度為0.20mg/mL對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20?L，以峰面積計(jì)算，所得RSD為0.57%（n=6），表明測(cè)定時(shí)的儀器精密度良好。
5.3 重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批號(hào)的BL供試品按“3.2”項(xiàng)下方法操作，配制成0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL的低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行配制3份，共9份，照“2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量，測(cè)得平均含量為100.35%，RSD為0.50%（n=9），表明方法重復(fù)性良好。
5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取室溫下放置的低、中、高3個(gè)濃度的供試品溶液，各取20?L在0，4，6，8，10，12h的條件下，按照“2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，測(cè)得RSD分別為1.7%、1.4%、1.3%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。
5.5 檢測(cè)限與定量限
精密吸取“3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，加甲醇逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣，記錄色譜圖，在信噪比（S/N）為3：1時(shí)測(cè)得檢測(cè)限為8ng，在信噪比（S/N）為10：1時(shí)測(cè)得的定量限為36ng。
6 樣品含量測(cè)定
按“3”項(xiàng)下的方法分別制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，各取20?L進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量，結(jié)果表明，3批樣品含量均在99.0%以上（見表1）。
7 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定
取BL供試品約20mg，精密稱定，置25mL棕色量瓶中，加甲醇適量，超聲助溶，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得0.80mg/mL的溶液作為供試品溶液。精密移取此溶液適量，用甲醇稀釋100倍，得自身對(duì)照溶液。以不加校正因子主成分自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量[7]。結(jié)果表明，有關(guān)物質(zhì)均在1%以內(nèi)（見表1）。
8 討論
8.1 波長(zhǎng)的選擇
取BL對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外掃描顯示其最大吸收波長(zhǎng)在228nm和317nm處，其中228nm處的吸收值最高，因此選擇228nm用于BL的含量測(cè)定，保證測(cè)定時(shí)有較高的靈敏度。
8.2 柱溫的選擇
考察了25℃、30℃、40℃的不同柱溫下對(duì)樣品分離效果的影響，實(shí)驗(yàn)表明，采用40℃的柱溫，可減小流動(dòng)相粘度、降低柱壓、縮短出峰時(shí)間并改善分離效果，故將柱溫定為40℃。
8.3 流動(dòng)相的選擇
根據(jù)BL的化學(xué)性質(zhì)，考慮采用酸性流動(dòng)相可以獲得較好效果。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)比較采用甲醇-乙酸-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，并且變換流動(dòng)相比例和乙酸濃度，最終確定流動(dòng)相為甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V），此條件下分離效果最好，保留時(shí)間適中。
8.4 穩(wěn)定性考察
由于BL的結(jié)構(gòu)特性，通常在溶液中不穩(wěn)定，且見光易分解[8-9]，考察了BL溶液在透明量瓶和棕色量瓶中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)BL溶液在透明量瓶放置8小時(shí)后含量顯著降低，而在棕色量瓶中的放置12小時(shí)含量變化不大，RSD小于2.0%，但是隨著時(shí)間增長(zhǎng)含量仍會(huì)緩慢降低。故在試驗(yàn)過(guò)程中需采取避光措施，并于配制后盡快使用。
8.5 結(jié)論
綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便且檢測(cè)限、定量限、精密度、重復(fù)性等均符合要求，故本法適用于對(duì)BL含量及其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于BL的質(zhì)量控制和使用安全有著十分重要的意義。
參 考 文 獻(xiàn)
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