ATP生物發(fā)光技術(shù)在食品工程中的應(yīng)用研究
摘 要：作為一種快速檢測微生物的新興技術(shù)，ATP生物發(fā)光法具有靈敏度高、快捷的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。本文分析了ATP的發(fā)光原理與特點(diǎn)，并探究了其在食品工程中的具體應(yīng)用。
關(guān)鍵詞：ATP生物發(fā)光法 應(yīng)用 食品
引言
在食品生產(chǎn)、銷售以及存儲等過程中，均需要通過微生物檢驗(yàn)來嚴(yán)格控制食品質(zhì)量，這是食品行業(yè)的重要管理內(nèi)容。關(guān)于微生物快速檢驗(yàn)的方法較多，如酶聯(lián)免疫法、PCR技術(shù)等。這些檢測技術(shù)大多采用瓊脂平板進(jìn)行微生物培養(yǎng)，可靠程度較高。但采用這種微生物培養(yǎng)方式，存在耗時較長的缺陷，一般需要培養(yǎng)兩至三天，因此檢驗(yàn)結(jié)果也相對滯后。在食品安全與衛(wèi)生監(jiān)測工作中，要想解決檢驗(yàn)結(jié)果滯后的問題，就需要找到更加便捷、準(zhǔn)確地檢驗(yàn)食品質(zhì)量的方法。而ATP生物發(fā)光法的靈敏度高，且操作簡便，因此被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。
一、ATP的生物發(fā)光原理與特點(diǎn)
1.1 ATP的生物發(fā)光原理
ATP在所有活體生物中均可提取出來，主要發(fā)揮著在生物體中傳遞化學(xué)能并存儲的作用。若生物體凋亡，則ATP在細(xì)胞內(nèi)各種酶的作用下會很快被分解。因此，對生物體中的ATP濃度進(jìn)行測定，就可以估算出活體細(xì)胞數(shù)目。ATP具備生物發(fā)光的機(jī)理，最早發(fā)現(xiàn)于1949年。Moyer等于1983年提出ATP可以反映活體細(xì)胞數(shù)量以及生物活性[1]。ATP能夠通過生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)發(fā)光，依賴于試劑中的螢火蟲熒光素酶。熒光素酶在鎂離子的作用下，可以與ATP發(fā)生反應(yīng)，之后活化的熒光素酶能夠結(jié)合熒光素，產(chǎn)生相應(yīng)的熒光素復(fù)合體，并釋放出光量子。這些復(fù)合體在氫氧化后可以生成發(fā)射光，最終產(chǎn)生氧化蟲熒光素。研究表明[2]，熒光素酶的適宜酸堿度在7.5左右，并且可以和作用底物ATP反應(yīng)，而ATP具有呈現(xiàn)S形的酶促動力學(xué)。熒光素酶的反應(yīng)速率與底物濃度有一定的關(guān)系，即ATP濃度越高反應(yīng)速率就越快，同時在檢測過程中也可以獲得更高的熒光素強(qiáng)度。在ATP保持較低濃度范圍時，其與熒光素酶的反應(yīng)速度呈現(xiàn)一級關(guān)系。而活體微生物在某個生物期內(nèi)，其ATP的含量是較為穩(wěn)定的，這樣就可以繪制出生物體中ATP的線性圖。微生物死亡后其中的ATP迅速被分解，不會影響到活體細(xì)胞數(shù)目的測定。由于ATP具備這樣的特性，因此在活體微生物測量中應(yīng)用較為廣泛。
1.2 ATP的生物發(fā)光特點(diǎn)
ATP生物發(fā)光法的操作較為簡便，且測量靈敏度高，能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時測量。在食品工程中對微生物進(jìn)行檢驗(yàn)時，要求樣品中微生物的濃度在每毫升1000以上，以保證測量準(zhǔn)確度符合衛(wèi)生學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。研究表明，在ATP濃度較低的情況下，熒光素復(fù)合體可以與超過90%的大腸桿菌結(jié)合，而普通顆粒所能結(jié)合的數(shù)目只有50%左右。該方法的最低檢測限為每毫升20cfu，作用時間只需要1小時，比其它方法相比時間更短，靈敏度更高。例如采用體熒光技術(shù)，對原奶中的大腸桿菌檢測，全過程所需時間約為10小時。而采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行大腸桿菌監(jiān)測，檢測限為每毫升1×105 cfu-1×106 cfu/ml，所需時間為1.5小時。但采用這種檢測方法，很難將非微生物與微生物ATP區(qū)分開來，而ATP樣品、食品中均含有各種離子，這些離子會對檢驗(yàn)過程帶來一定的干擾，對熒光素酶的發(fā)光作用也可能有抑制。
二、ATP在食品工程中的應(yīng)用范圍
2.1 在食品微生物檢測中的應(yīng)用
在食品行業(yè)中ATP生物發(fā)光技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域較多，主要是通過測定食品中微生物的含量，進(jìn)而對食品質(zhì)量進(jìn)行判定。例如，采用這種方法可以對肉制品中的微生物進(jìn)行測定，進(jìn)而了解細(xì)菌污染的程度。與常規(guī)的細(xì)菌菌落培養(yǎng)法相比，采用ATP生物發(fā)光技術(shù)的靈敏度更高，但兩者也存在相關(guān)性。在乳制品中采用這種測定方法，可以快速測定乳酸菌的水平。此外，在各種調(diào)味品、啤酒等微生物測定中，ATP發(fā)光法也有重要應(yīng)用。研究表明[3]，采用常規(guī)瓊脂平板細(xì)菌培養(yǎng)法與ATP發(fā)光法也有一定的相關(guān)度。此外，可以采用對ATP生物發(fā)光法進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而對面粉中的微生物含量進(jìn)行測定。通過優(yōu)化后，設(shè)定熒光素酶為50mg/L，熒光素為70mg/L，鎂離子為0.25mol/L。生肉類食品由于體細(xì)胞ATP對結(jié)果的干擾較大，因此需要清除掉樣品中體細(xì)胞ATP，其采用的方法是首先用0.2%的TritonX-100 和0.15%的apyrase混合液清除體細(xì)胞ATP，然后加入3%的三氯乙酸混合并振搖1min，離心后取上清檢測ATP，該光值即為細(xì)菌ATP發(fā)光值，整個過程需15min。而熟肉類中非細(xì)菌ATP含量低，對結(jié)果影響較小可以省略清除體細(xì)胞ATP步驟而直接測定，整個過程需4min。經(jīng)過38份樣品實(shí)驗(yàn)對比，ATP生物發(fā)光法檢測結(jié)果與細(xì)菌菌落平板計(jì)數(shù)方法之間具有良好的線性關(guān)系(r=0.98)[4]。
2.2 在食品生產(chǎn)環(huán)境清潔度方面的應(yīng)用
在食品生產(chǎn)與銷售的整個過程中，均需要分析各種影響食品安全的因素，并對該過程的重點(diǎn)環(huán)節(jié)進(jìn)行有效控制，且依據(jù)相應(yīng)的衛(wèi)生管理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行管理。在對食品安全進(jìn)行監(jiān)測與管理過程中，需要做好各類食品的微生物監(jiān)測工作，對各類食品的生產(chǎn)與流通環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測，保障其有較高的清潔度，準(zhǔn)確記錄各類監(jiān)測數(shù)據(jù)，以降低食品安全事故的發(fā)生率。對于食品生產(chǎn)環(huán)境清潔度的測定，常規(guī)的方法就是平板細(xì)菌培養(yǎng)與取樣法，通過培養(yǎng)微生物來測定食品表面微生物的含量。但是這種傳統(tǒng)的細(xì)菌測定方式周期較長，測定的結(jié)果相對滯后，缺乏實(shí)用性，無法滿足食品工程中對環(huán)境清潔度的管理要求。
在食品生產(chǎn)安全監(jiān)測工作中，食品殘?jiān)梢钥醋鲎顬橹饕奈廴驹�，而各類食品中均可提取出耐熱性高的ATP。因此，通過ATP生物發(fā)光技術(shù)，可以對食品生產(chǎn)與流通過程中的環(huán)境清潔度進(jìn)行快速測定，進(jìn)而保障食品生產(chǎn)滿足相應(yīng)的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。例如，在食品加工過程中，采用ATP測定法可以對生產(chǎn)線、操作臺等部位的微生物進(jìn)行快速測定，進(jìn)而明確這些部位的清潔度。首先在選定測試區(qū)域內(nèi)，滴加2滴ATP 釋放液，用無菌棉拭子均勻涂抹測試樣品，采樣面積為100cm2;然后在棉拭子頭部滴加6滴ATP釋放液，提取ATP;最后立即將拭子頭部ATP提取液點(diǎn)在檢測膜上，用ATP熒光儀測定生物發(fā)光值(RLU)，同時采用國標(biāo)法檢測大腸菌群和細(xì)菌總數(shù)。其中規(guī)定大腸菌群陽性為不合格，細(xì)菌總數(shù)以大于500cfu/100cm2 為不合格，ATP 生物發(fā)光法以RLU大于600為不合格。在282份樣品中，3種檢驗(yàn)方法所測出不合格樣本的陽性率分別為23.4 %、25.5 %、9.4 %。ATP生物發(fā)光法的.陽性率與大腸菌群和細(xì)菌總數(shù)的陽性率沒有顯著性差異(P>0.05)[6]。此外，對于食品存儲場所，如食品盛放器皿、冰箱等也可以測定微生物水平。研究表明[5]，采用這種方法進(jìn)行清潔度測定，與常規(guī)的瓊脂平板法具有相似性，且操作性更強(qiáng)。我們也可以將酵母菌毒素測定與這種方法聯(lián)合使用，以此更好地為食品安全監(jiān)測服務(wù)。目前，ATP發(fā)光技術(shù)與其它食品安全檢測技術(shù)聯(lián)用的較多，如與酶聯(lián)免疫法、PNA探針的聯(lián)合使用等。
2.3 在RMDS系統(tǒng)中的應(yīng)用
RMDS系統(tǒng)由ATP發(fā)光反應(yīng)裝置、過濾膜、數(shù)據(jù)處理以及熒光增強(qiáng)裝置等構(gòu)成。待測樣品在經(jīng)過過濾膜后，需要經(jīng)過一段時間的膜溫培養(yǎng)，然后將其從培養(yǎng)皿上分離，在烘干后加入ATP提取劑，之后將熒光素酶噴灑在烘干的膜上。通過RMDS系統(tǒng)可以發(fā)現(xiàn)每一個微生物菌落產(chǎn)生的光斑，而通過熒光增強(qiáng)系統(tǒng)可以增強(qiáng)熒光，并獲取相應(yīng)的熒光圖像。在系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理裝置中可以對這些圖像進(jìn)行處理與存檔，進(jìn)而獲取相應(yīng)的數(shù)據(jù)用于計(jì)量微生物數(shù)量。
三、結(jié)語
ATP生物發(fā)光技術(shù)具有獨(dú)特的微生物檢測優(yōu)勢，而其與其它檢測技術(shù)的應(yīng)用將提高檢測效率，是食品流通與環(huán)境監(jiān)測中測定微生物的有效方法。相信隨著ATP技術(shù)的不斷完善與成熟，其在食品、環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)藥等領(lǐng)域?qū)⒂懈鼮閺V泛的應(yīng)用。
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