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研非復制性腺病毒攜帶AT2
0 引言
1975 年Kohler 和Milstein 首先報道，用細胞雜交技術，使經綿羊紅細胞(SRBC)免疫的小鼠的脾細胞，與小鼠的骨髓瘤細胞融合，并由此創建了第一個B 細胞雜交瘤細胞株，獲得了抗SRBC 的單克隆抗體。他們首先創立了將能分泌特異性抗體的B 淋巴細胞同無限繁殖的骨髓瘤細胞融合技術，為單克隆抗體的制備奠定了基礎。這是免疫學，乃至醫學史上的一個里程碑。
單克隆抗體以特異性高、性質均一和針對特定靶點定向制備等諸多優點而廣泛應用于各種疾病的治療，特別是在腫瘤領域內的應用備受關注。美國FDA 先后批準了10 多個用于治療腫瘤的抗體藥物，都是全長抗體。雖然單克隆抗體在腫瘤治療中發揮了重要的作用，但全長單克隆抗體治療腫瘤成本太高：治療腫瘤的抗體需要量極多且純度要求高，目前的生物制藥工藝難以滿足市場的需求，大規模、高密度的哺乳動物細胞培養技術是目前國際上的一大難題，這些均導致高生產成本及昂貴的價格，一般患者難以承受。
因此，本課題的目的是利用非增殖腺病毒作為載體攜帶全長抗體基因在體內表達全長抗體，這樣可以避免在體外用哺乳動物細胞表達抗體，以及純化等復雜而且昂貴的規程。AT2是一個對腫瘤有明顯療效的抗EGFR 單克隆抗體Cetuximab。由于EGFR 在很多腫瘤中都有過量表達，在腫瘤的發生、生長、抗藥性和轉移性中都起到了重要的作用。Cetuximab 對過量表達EGFR 的腫瘤有良好的治療作用，現已被批準用于頭頸癌、直腸癌和肺癌的治療，無論是單獨使用還是與其它藥物聯合應用都有很好的效果，只有很小的副作用，出現嚴重反應的概率不及萬分之一。Cetuximab 單抗應用其它腫瘤治療的研究也在大力的開發中，在腫瘤的治療中有很大應用前景，但是由于其生產成本過高，國內普通患者難以承擔，而抗體基因治療正好解決了這個問題。本研究根據人體內密碼子的偏愛性選擇修改了部分氨基酸密碼子，構建了修改密碼子后的重組腺病毒載體。體外實驗表明，通過修改密碼子后提高了抗體的表達量，通過Western 和IFN 實驗檢驗，無論修改密碼子與否，重組腺病毒在293 細胞中表達的抗體與商品化的 Cetuximab 單抗相近的特性，分子量大小一致，與抗原EGFR 有很好的結合，說明我們構建的載體表達的抗體是有活性的。
1. 材料和方法
1.1 材料5 型腺病毒骨架質粒pBHGE3（加拿大Microbix Biosystems 公司），人表皮鱗癌細胞株A431、SK-Br-3 細胞和人胚胎腎細胞293 細胞(購于ATCC)，DMEM 細胞培養液，胎牛血清FBS(購于GIBCO 公司),穿梭載體pDC339 (本實驗室構建)。引物和抗體基因由上海生工公司合成。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養A431 細胞、SK-Br-3 細胞和293 細胞在5%CO2，37℃ 條件下培養，培養液為含10%FBS的DMEM。
1.2.2 構建攜帶抗體基因重組
腺病毒載體我們首先分別合成修改密碼子前后的AT2 抗體基因的輕鏈及重鏈，且在輕鏈及重鏈前面各自合成抗體的信號肽基因，用IRES 元件連接抗體的輕鏈和重鏈基因，以實現AT2 抗體的重鏈和輕鏈的平衡性及完整性，經PCR 引入酶切位點后，逐步把重輕鏈基因裝入載體pDC339 中。
經過酶切和 PCR 鑒定后測序。PCR 鑒定穿梭載體pDC339-AT2 和pDC339-NAT2(修改過密碼子)重、輕鏈的引物分別是GT340+GT341（輕鏈）、GT342+ GT343（重鏈）和ATNL-1+ ATNL-4（輕鏈）、 ATNH-1 +ATNH-4（重鏈）。測序正確后的穿梭載體與5 型腺病毒骨架質粒pBHGE3 利用轉染試劑Lipofectamine 2000 共轉染至293 細胞，通過同源重組的方法獲得攜帶目的基因的重組病毒。共轉染后9～14 d 出現病毒空斑，經過PCR 法鑒定目的基因正確后，得到表達Cetuximab 抗體的重組腺病毒載體Ad5-AT2 和Ad5-NAT2。簡化示意圖如下：
1.2.3 病毒擴增和純化
病毒滴度測定重組腺病毒載體Ad5-AT2 和Ad5-NAT2 經鑒定正確后進行大擴后，用HPLC 法在純化車間純化，應用50%組織培養感染劑量法(TCID50)測定病毒滴度。
1.2.4 重組腺病毒表達的抗體檢測
實驗鋪板 293 細胞，培養過夜后，按MOI=10 分別加入兩個病毒，收上清用于抗體的檢測實驗。用雙夾心ELISA 法測定抗體的表達量；用Western 鑒定其與商品化的Cetuximab 單抗比較分子量大�。婚g接免疫熒光實驗是根據抗原抗體反應的原理，用熒光標記抗體作為分子探針，檢查抗體Cetuximab 與A431 細胞膜上的抗原EGFR 結合的特異性，同時用EGFR 陰性的SK-Br-3 細胞做陰性對照。
2. 結果
腺病毒穿梭載體pDC339-AT2 和pDC339-NAT2 的酶切和PCR 鑒定結果。
應用50%組織培養感染劑量法(TCID50)測定病毒滴度，Ad5-AT2 和Ad5-NAT2 的病毒滴度分別是1.2×1010pfu/ml，1.0×1010pfu/ml。
用雙夾心 ELISA法測定病毒抗體的表達量：Ad-AT2 與Ad-NAT2 相比的表達量分別是：
25.2±5ng/ml 和285.3±5ng/ml，通過修改密碼子較大的提高了抗體的表達量。
重組腺病毒Ad-AT2、Ad339-NAT2 按MOI＝10 轉染細胞株293，感染72 小時后用Western Blot 方法檢測細胞上清中Cetuximab 抗體與商品化的抗體比較分子量大小。查看EFNB2與精神分裂癥樣本的關聯。
3 討論
治療各種疾病、頑癥中有巨大的優勢，但是由于其自身的某些性質，加上目前我們的生產抗體的技術和工藝，限制了抗體的應用。在當前的生產抗體的工藝比較復雜，需要綜合多項技術，工藝和技術都被少數公司壟斷，而且抗體的需要量也在增大，最后導致抗體的治療成本極高。
為了降低成本和提高抗體治療效果，基因治療是一種新型有效的手段，我們可以通過把全長抗體基因裝入載體，通過載體帶進體內，是抗體在體內表達。這樣既可以免去體外生產抗體眾多復雜的過程，降低成本，又可以使抗體更好的在體內持續作用，更好的到達組織。
因此，如何找到一個安全的，有效的載體是關鍵。腺病毒成為一個重要的載體，由于我們對其研究得比較清楚，我們對其進行改造，刪除負責病毒復制的E1A 區以及其它多余的區域。
腺病毒作為載體應用于基因治療中有眾多優點，在目前的條件下，腺病毒載體相對于其它載體，更適合作為基因治療的載體。
根據密碼子的偏愛性，我們收集了高表達的氨基酸密碼子，修改了部分抗體基因的密碼子，以此來提高抗體的表達量。經Western 鑒定和IFN 實驗證明腺病毒載體表達的抗體是完整和有活性的，特異性也很好，可以應用下一步的治療研究。
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