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格列喹酮促進C2C12細胞攝取葡萄糖
1 引言
胰島素抵抗和β細胞功能缺陷是2 型糖尿病特征性病理生理學改變，其中胰島素抵抗是2 型糖尿病的發病機制中一重要環節，胰島素抵抗主要表現之一為胰島素敏感組織(肌肉、脂肪組織)葡萄糖攝取減少。格列喹酮作為第二代磺脲類藥物，其主要作用是通過促進胰島素分泌而控制血糖。隨著學者們對磺脲類藥物作用機理研究的深入，格列喹酮經典途徑以外的降糖機制也逐漸引起大家的關注。Rinninger F 等[i]研究發現，格列喹酮可通過誘導體外培養的肝臟細胞糖原合成增加而發揮胰腺外作用，Marco 等[ii]研究發現格列喹酮可誘導3T3-L1成纖維細胞PPARγ 靶基因GLUT4 的表達，其作用效應與吡格列酮相近。本研究旨在通過體外葡萄糖攝取實驗，觀察格列喹酮對C2C12 細胞葡萄糖攝取作用及對胰島素刺激的糖攝取的影響，并初步探討格列喹酮的胰腺外降糖作用機制，為進一步闡明其臨床作用提供新的實驗依據。
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 細胞株
小鼠成肌細胞株(C2C12) ,由德國烏爾姆大學劉躍飛教授惠贈。
2.1.2 主要試劑
DMEM 培養基（Gibco 產品，高糖型），胎牛血清（杭州四季青公司），馬血清（Gibco產品），胰蛋白酶、DEPC、溴化乙錠（Sigma 公司），Trizol（Invitrogen 公司），逆轉錄酶MMLV 酶、Taq 酶（MBI 公司），GLUT4 及β-actin 引物由上海生工合成，100 bp LadderDNA Marker (Axyden 公司)，瓊脂糖（Gibco 公司），3H -2-脫氧葡萄糖（Amersham 產品），格列喹酮（北京萬輝雙鶴藥業），其它試劑均為國產分析純。
2.2 方法
2.2.1 C2C12 的培養
加入含 10%胎牛血清的DMEM 培養基，置于37℃、含5％CO2 的培養箱中培養，隔日換液，待細胞生長至70％~80％融合時按1：4 傳代。
2.2.2 C2C12 誘導分化
C2C12 細胞達80%左右融合時，傳代接種于干預板中，待生長至80%~90%融合時，換用分化培養基（含2%馬血清的DMEM 培養基）誘導分化(day0)，每24 小時換液一次；5-7天后90%以上成為成熟骨骼肌細胞用于實驗。
2.2.3 葡萄糖氧化酶法檢測細胞培養基中葡萄糖水平
細胞接種于 6 孔板，給藥組在細胞分化后分別加入含10-5mol/L 的格列喹酮、10-7mol/L胰島素以及10-5mol/L 格列喹酮+10-7mol/L 胰島素的DMEM，同時設立空白組、不含細胞的DMEM 組。溫育12 h 后再將培養基移出并用葡萄糖氧化酶法檢測培養基中的含糖量。用DMEM 組含糖量的平均值減去其余各孔的含糖量，即是12h 各孔細胞的葡萄糖消耗量。收集細胞提取總RNA。
2.2.4 采用四甲基偶氮唑鹽法評估格列喹酮對C2C12 細胞增殖的影響
取體外培養的C2C12 細胞，0.25%的胰酶溶液消化，制成單細胞懸液，1000 r/min 離心5min，以含10％胎牛血清的DMEM 培養基重懸。血細胞計數板進行細胞計數，細胞懸液密度為3.4×106 /L，接種至96 孔板，200μL/孔。實驗共分4 組：空白對照組、10-7mol/L 胰島素組、10-5mol/L 格列喹酮組、格列喹酮+胰島素組，6 個平行孔/組。各組在37℃、5％CO2細胞培養箱內常規培養。待細胞融合率達80%且未出現細胞分化時，藥物組分別向C2C12細胞中加入含對應濃度藥物的無血清培養基，空白對照組則向C2C12 細胞中加入單純無血清培養基。各組細胞干預12 h 后進行四甲基偶氮唑鹽檢測。即每孔加入5mg/mL 的四甲基偶氮唑鹽液20μL，37℃繼續培養4 h，鏡下可見紫藍色針狀結晶。吸出孔內培養基后，每孔加入二甲基亞砜200μL，室溫下將平板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，待結晶物溶解后，置于酶聯免疫儀于490 nm 處檢測各孔吸光度值。
2.2.5 3H -2-脫氧葡萄糖攝取實驗
細胞接種于 24 孔板，給藥組在細胞分化后分別加入含 10-5mol/L 的格列喹酮、10-5mol/L格列本脲的DMEM，同時設立空白組。用KRP 緩沖液洗滌3 次后，加入含10-7mol/L 胰島素的KRP 緩沖液，在37℃繼續培養30min，然后加入3H -2-脫氧葡萄糖，使終濃度為3.7×104Bq/L，作用15 min 后，用冷PBS 洗滌3 次，用0.1mol/L 的NaOH 裂解細胞，取細胞裂解液用液閃儀計數其每分鐘計數(CPM)。每一樣本測定的CPM 值用與對照組的比例表示。
2.2.6 RT-PCR 法檢測GLUT4 mRNA 表達
采用 Trizol 一步法提取各組細胞的總RNA，經紫外分光光度計測定RNA 的A260nm 與A280nm 比值在1.60～1.90 之間。取4μl 總RNA 為模板逆轉錄，根據文獻，并與從Gene Bank上下載的人GLUT4 mRNA、β-actin mRNA 核苷酸序列核對，由上海生工合成GLUT4 和β-actin 單核酸引物。GLUT4 上游: 5’- gcccgaaagagtctaaagcg -3’ ， 下游: 5’-actaagagcaccgagaccaa-3’，擴增產物長312bp。β-actin 上游:5’- cgtgcgtgacattaaagag -3’，下游: 5’-ctggaaggtggacagtgag- 3’，擴增產物長435bp。擴增條件: 95℃ 5min 預變性，然后95℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 45s 進行35 個循環，再以72℃延伸10min，再以72℃延伸10min。反應完成后取5μl PCR 產物于2%瓊脂糖凝膠（含0.5mg/ L 溴化乙錠）電泳，用Sensicapture 自動凝膠成像分析儀掃描凝膠圖譜，LabImage 分析軟件對RNA 條帶進行分析，得出GLUT4 與內參照條帶β-actin 的吸光度比值，比較各組GLUT4mRNA 相對表達情況。
2.3 統計學處理
應用 SPSS 13.0 軟件包對實驗數據進行統計，所有數據都用?x±s 表示，采用one-wayANOVA 進行顯著性檢驗，組間比較采用S-N-K 檢驗，以P < 0.05 為差異有統計學意義。
3 結果
3.1 格列喹酮對C2C12 細胞培養基中葡萄糖消耗的影響
結果顯示，干預12h 后，胰島素組C2C12 細胞葡萄糖消耗量明顯增加，高于空白組（12.34±0.55 vs 7.86±0.63，P<0.01），格列喹酮組細胞耗糖量亦明顯增加（10.95±0.46 vs 7.86±0.63，P<0.01），格列喹酮+胰島素組細胞耗糖量較胰島素組增多（13.77±0.73 vs 12.34±0.55，P<0.01）。
3.2 格列喹酮對C2C12 細胞增殖的影響
四甲基偶氮唑鹽檢測結果表明，細胞處理12 h 后，與空白組比較, 胰島素組、格列喹酮+胰島素組平均吸光度值均顯著增加（0.74±0.09，0.76±0.09 vs 0.54±0.06，P<0.01），而格列喹酮組平均吸光度值無明顯變化（0.55±0.089 vs 0.52±0.063，P>0.05）。
3.3 格列喹酮對C2C12 細胞葡萄糖攝取的影響
C2C12 細胞在基礎狀態下對葡萄糖有一定的攝取，胰島素刺激可使細胞葡萄糖攝取增加（為空白組的1.68±0.09 倍，P<0.01）；10-5mol/L 的格列喹酮、10-5mol/L 格列本脲孵育細胞12h 后，與空白組相比，細胞對葡萄糖的攝取均增加（分別為1.52±0.23 倍、1.23±0.16 倍，P<0.01）；與格列苯脲相比，格列喹酮組細胞葡萄糖攝取增高更明顯（P<0.01）；在胰島素存在的情況下，格列喹酮組細胞葡萄糖攝取明顯增加（為空白組的1.93±0.12 倍，P<0.01），且高于胰島素組（P<0.01），見格列喹酮對C2C12 細胞葡萄糖攝取的影響。
3.4 格列喹酮對C2C12 細胞GLUT4 mRNA 表達的影響
胰島素和格列喹酮干預C2C12 細胞12 小時結果顯示，胰島素組GLUT4 mRNA 表達高于空白組（0.73±0.04 vs 0.47±0.02，P<0.01），格列喹酮組GLUT4 mRNA 表達與空白組相比無明顯差異（0.50±0.02 vs 0.47±0.02，P>0.05），格列喹酮+胰島素組與胰島素組相比無明顯差異（0.50±0.03 vs 0.50±0.02，P>0.05）。
4 討論
格列喹酮作為第二代磺脲類藥物，其主要作用是通過促進胰島素分泌和增強胰島素的外周作用來控制血糖，此外，它還具有廣泛的胰腺外作用。Yarat 等[iii]研究顯示，格列喹酮可顯著減少糖尿病大鼠晶狀體內非酶糖基化蛋白及總蛋白水平，顯著增加谷胱甘肽水平。
Yanardag 等[iv]發現格列喹酮對糖尿病大鼠的肝臟損傷有保護效應。另有研究顯示，格列喹酮能抑制糖基化終產物誘導的人腎系膜細胞（HRMC）正常 T 細胞表達分泌的調節活化蛋白（RANTES）的表達和分泌[v]，提示格列喹酮可降低具有較強趨化炎癥細胞作用的RANTES水平從而可能在糖尿病腎病的防治中發揮一定的作用。
胰島素抵抗是2 型糖尿病發病機制中一重要環節，經典定義是指需要超過正常量的胰島素才能在胰島素的效應器官產生正常生理效應，現代的胰島素抵抗概念則泛指胰島素促進周圍組織攝取和利用葡萄糖的作用減低[vi]。骨骼肌占人體重的40%以上，是胰島素刺激狀態下攝取葡萄糖和代謝葡萄糖的最主要組織之一，在體內糖代謝平衡中發揮重要作用。葡萄糖是一種極性分子，不能以自由擴散的方式通過細胞膜，絕大多數組織細胞都必須借助細胞膜上的葡萄糖轉運體（GLUTs），通過易化擴散的方式攝入葡萄糖。GLUTs 有多種亞型，其中GLUT1 主要分布于腦部血管內皮細胞(包括血腦屏障)和紅細胞膜上，也低水平表達于脂肪組織、肌肉和肝臟，這種廣泛表達的GLUT1 為許多細胞提供基礎狀態下的葡萄糖轉運。
GLUT4 是存在于骨骼肌、脂肪組織中轉運葡萄糖的載體，它的表達和功能的改變可能涉及肌肉和脂肪細胞胰島素抵抗[vii，viii，ix]。
本實驗選用源于小鼠的成肌細胞株C2C12，通過馬血清誘導其退出細胞增殖周期，促進其分化為成熟骨骼肌細胞[x]。采用葡萄糖消耗實驗，觀察在格列喹酮處理下培養基中葡萄糖消耗程度，可以直觀地反映該藥物對骨骼肌細胞糖代謝的影響。結果顯示：在無胰島素存在的情況下，格列喹酮能增加C2C12 細胞耗糖量，但未見其對細胞活力有影響，提示這種耗糖量的增加并不是因為細胞活力變化引起的，從而認為可能是葡萄糖攝取增多的結果；聯用胰島素和格列喹酮進行處理時，呈現明顯的協同降糖作用。鑒于葡萄糖消耗實驗觀察的是細胞在一段時間內消耗葡萄糖的總和，在這段相對“漫長”的時間內，除了GLUT4 之外，骨骼肌細胞中存在的其他的一些非胰島素敏感的、轉運速度緩慢而持久的GLUT1 等載體對葡萄糖轉運作用可能都疊加在一起。而葡萄糖攝取實驗觀察的是在短時間內細胞對同位素標記的脫氧葡萄糖的攝取，考察的是格列喹酮對細胞快速攝取葡萄糖能力的影響，對于骨骼肌和脂肪等胰島素敏感細胞，主要反映的是對GLUT4 功能的影響。結果顯示，C2C12 細胞在基礎狀態下對葡萄糖有一定的攝取，但在胰島素刺激以后，增加倍數不明顯，10-7mol/L 的胰島素刺激下糖攝取能力增加也不到2 倍，這與文獻報道的C2C12 細胞系的GLUT4 表達量相對不足相一致，即使分化融合為肌管后對胰島素的反應性也較差[xi，xii]。實驗觀察到格列喹酮干預C2C12 細胞12h 后表現出促進細胞糖攝取的效應，且能增強胰島素依賴的葡萄糖攝取作用，與葡萄糖消耗實驗結果基本一致。
胰島素和肌肉收縮被認為是調節骨骼肌糖代謝的主要生理因素，且兩者的作用有協同性[xiii]。一般認為可從三方面來調節 GLUT4 的功能，增加骨骼肌對葡萄糖的攝取。首先可通過上調 GLUT4 蛋白的含量，可能的機制是促進 GLUT4 的基因表達和蛋白合成，或減少其降解，或是兩者兼有；其次是通過增加 GLUT4 的轉位，使細胞膜上的 GLUT4 增多，從而促進葡萄糖的攝��；還可以通過調節細胞膜上的 GLUT4 內在活性，這可能是通過直接調節GLUT4 本身或通過與其他調節分子相互作用而實現的[xiv]。本研究結果顯示格列喹酮能促進C2C12 細胞葡萄糖攝取，但并未發現其增加細胞GLUT4 基因表達，推測其促細胞攝取葡萄糖的作用可能存在其它機制，如對GLUT4 翻譯水平的正向調節作用、增加GLUT4轉位或增強其內在活性等。因此格列喹酮對GLUT4 的作用還有待于進一步研究。
5 總結
本研究表明格列喹酮能促進小鼠骨骼肌細胞葡萄糖攝取，且可增加胰島素介導的葡萄糖的轉運，提示格列喹酮可能改善胰島素的敏感性。細胞對葡萄糖的攝取是一個復雜的信號轉導過程，關于格列喹酮刺激糖吸收的機制以及與胰島素信號通路中其它因子的關系，尚待進一步的研究。
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參考文獻
[i] Rinninger F., Kirsch D., Haring H. U., et al. Extrapancreatic action of the sulphonylurea gliquidone:post-receptor effect on insulin-stimulated glycogen synthesis in rat hepatocytes in primary culture[J]. Diabetologia,1984, 26:462-465.
[ii] Scarsi M, Podvinec M, Roth A, et al. Sulfonylureas and glinides exhibit peroxisome proliferator-activatedreceptor γ activity: a combined virtual screening and biological assay approach[J]. Mol Pharmacol, 2007,71:398-406.
[iii] Yarat A, Tunali T, Yanardag R, et al. The effect of glurenorm( gliquidone) on lenses and skin in experimentaldiabetes[J]. Free Radic Biol Med, 2001, 31:1038-1042.
[iv] Yanardag R, Ozsoy-Sacan O, Orak H, et al. Protective effect s ofglurenorm (gliquidone) treatment on the liverinjury of experimental diabetes[J]. Drug Chem Toxicol, 2005, 28:483-497.
[v] 周莉, 孫子林. 格列喹酮對糖基化終產物誘導的人腎系膜細胞 RANTES 表達的影響[J]. 中國糖尿病雜志, 2008, 16:495-497.
[vi] Chekulayeva LV, Shevchuk IN, Chekulayev VA, et al. Hydrogen peroxide, superoxide, and hydroxylradicalsare involved in the phototoxic action of hematoporphyrin derivative against tumor cells[J]. Environ Pathol ToxicolOncol, 2006, 25:51-77.
[vii] Kelley DE, Minton MA, Watkins SC, et a1. The effect of non-insulin dependent diabetesmellitus and obesity on glucose transport and phosphorylation in skeletal muscle[J]. J Clin Invest, 1996,97:2705-2713.
[viii] Abel ED, Peroni 0, Kim JK, et a1. Adipose selective targeting of the GLUT4 gene impairsinsulin action in muscle and liver[J]. Nature, 2001, 409:672-673.
[ix] Maianu L, Keller SR, Carvey WT. Adipocytes exhibit abnormal subcellulardistribution ofvesicles containing GLUT4 and insulin regulated aminopeptidase in type 2 diabetes mellitus: implicationsregulating defects in yesicle trafficking[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2001, 86:5450-5545.
[x] Goto S, Miyazaki K, Funabiki T, et al. Serum-free culture conditions for analysis of secretory proteinasesduring myogenic differentiation of mouse C2C12 myoblasts[J]. Anal Biochem, 1999, 272:135-142.
[xi] Kotliar N, Pilch PF. Expression of the glucose transporter isoform GLUT 4 is insufficient to conferinsulin-regulatable hexose uptake to cultured muscle cells[J]. Mol Endocrinol. 1992, 6:337-345.
[xii] Sargeant R, Mitsumoto Y, Sarabia V, et al. Hormonal regulation of glucose transporters in muscle cells inculture[J]. J Endocrinol Invest. 1993, 16:147-162.
[xiii] Kemppainen J, Stolen K, Kalliokoski KK, et al. Exercise training improves insulin stimulated skeletal muscleglucose ptakeindependent of changes in perfusion in patients with dilated cardiomyopathy[J]. J Card Fail, 2003,9:286-295.
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