細胞工程論文
細胞工程是生物工程的一個重要方面�？偟膩碚f，它是應用細胞生物學和分子生物學的理論和方法，按照人們的設計藍圖，進行在細胞水平上的遺傳操作及進行大規(guī)模的細胞和組織培養(yǎng)。下面是小編為大家整理的細胞工程論文，歡迎閱讀。
【摘要】目的制作去細胞肌肉組織工程支架，并檢測其與人羊膜上皮細胞的生物相容性。方法 采用TNT和十二烷基磺酸鈉結合的化學萃取方法制作去細胞肌肉組織工程支架，冰凍切片觀察其結構。將人羊膜上皮細胞種入支架培養(yǎng)7 d后，用免疫組化檢測羊膜上皮細胞的增殖活性、NT3及BDNF的表達,掃描電子顯微鏡觀察其超微結構。結果 支架中細胞去除完全，其主要結構為平行排列的管狀結構。細胞外基質的主要成分彈性纖維和膠原纖維保持完好。羊膜上皮細胞在支架里有增殖活性，并呈現NT3、BDNF免疫反應陽性。掃描電鏡顯示，羊膜上皮細胞在支架中分布均勻，生長良好。結論 成功的制作了去細胞肌肉組織工程支架，其與人羊膜上皮細胞有良好的相容性。
【關鍵詞】去細胞肌肉;人羊膜上皮細胞;生物相容性
近年來組織工程研究的重要進展之一就是采用自體或異體移植物制作天然生物降解材料的組織工程支架。其中去細胞移植物與機體有良好的生物相容性。去細胞肌肉支架可作為生物工程支架支持神經細胞軸突再生。Mligiliche等〔1〕把去細胞肌肉移植入大鼠坐骨神經缺損處,4 w后發(fā)現有大量神經軸突長入去細胞肌肉支架中。由于單獨應用去細胞肌肉支架治療神經系統(tǒng)疾病的效果有限，去細胞肌肉支架要發(fā)揮更大的作用往往需要向支架中植入種子細胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮細胞可分泌多種神經因子〔4，5〕，促進神經元軸突的生長，是一種良好的治療神經系統(tǒng)疾病的種子細胞。本研究利用化學去細胞的方法制成去細胞肌肉支架，并把羊膜上皮細胞種入去細胞肌肉支架內，探究兩者的相容性，為開展組織工程治療神經系統(tǒng)方面的疾病提供新的途徑。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物 Wistar 大鼠由吉林大學白求恩醫(yī)學院實驗動物中心提供。
1.1.2 試劑 IMDM培養(yǎng)基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 單克隆抗體購自Neomarker公司;神經營養(yǎng)素(NT)3,腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德公司，SABC免疫組化試劑盒購自福州邁新生物公司。人羊膜上皮細胞株為本實驗室保存。
1.2 方法
1.2.1 去細胞肌肉支架的制備 參考 Brown等〔6〕去細胞膀胱的制作方法制備去細胞肌肉支架，簡述如下：取Wistar大鼠腹鋸肌，放入蒸餾水中，在搖床中以37℃、50 r/min搖48 h后,轉入3%的TritonX100溶液,搖床中37℃、50 r/min搖48 h。然后放入蒸餾水中，搖床37℃、50 r/min搖48 h。換成1% SDS溶液，搖床37℃，50 r/min搖48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 支架形態(tài)結構的觀察及成分鑒定 肉眼觀察去細胞肌肉的形態(tài)。去細胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖過夜以梯度脫水，OCT包埋，冷丙酮速凍，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片機切片，HE 染色，觀察其內部結構。此外對切片進行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)檢測支架的細胞外基質成分。
1.2.3 人羊膜上皮細胞的培養(yǎng) 人羊膜上皮細胞在DMEM培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml鏈霉素，200 μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5 % CO2及飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待單層培養(yǎng)細胞生長至80%匯合后，傳代培養(yǎng)。
1.2.4 人羊膜上皮細胞與去細胞肌肉支架相容性的鑒定
1.2.4.1 取生長良好的人羊膜上皮細胞，80%細胞接近融合，棄去培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化，當胞體回縮，細胞間隙變寬時，用血清終止消化，反復輕吹瓶壁細胞，制成單細胞懸液于離心管中，1 000 r/min，離心3 min。用DMEM重懸細胞。用1 ml注射器吸入細胞懸液，以2×106/ml 密度注入去細胞肌肉支架中分裝至24孔板中，在37℃、5 % CO2及飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，培養(yǎng)1 w。摻入Brdu(終濃度為10 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)1 d后，恒冷箱切片機切片(方法同前)。切片經PBS 洗后，3% H2O2滅活內源性過氧化物酶10 min，血清封閉20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀釋)單克隆抗體，BDNF和NT3多克隆抗體(1∶100稀釋)4℃孵育過夜，PBS 洗后，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗后，SABC37℃孵育30 min，DAB顯色。光鏡下觀察。
1.2.4.2 掃描電子顯微鏡鑒定羊膜上皮細胞在去細胞肌肉支架上的生長情況 取生長良好的人羊膜上皮細胞，80%細胞接近融合時，用上述方法消化下來后，把羊膜上皮細胞種植到去細胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脫水，CO2臨界點干燥，鍍膜，采用掃描電子顯微鏡觀察并拍照。
2 結 果
2.1 支架的組織結構與成分 去細胞肌肉外觀呈乳白色,半透明,質地柔軟。從大體上看，肌肉去細胞前后整體大小與形狀無顯著變化。支架縱切面的HE染色觀察可見骨骼肌細胞成分消失,而纖維網架結構保持完整，支架內主要為平行管道。VG+ET染色證明支架成分主要為膠原纖維和彈力纖維等細胞外基質成分，膠原纖維為紅色波浪狀結構，彈性纖維為藍色絲狀結構，見圖1。
2.2 羊膜上皮細胞與去細胞肌肉支架的兼容性 見圖2，HE染色顯示人羊膜上皮細胞在支架中生長良好，分布均勻(圖
圖1 去細胞肌肉支架大體與組織切片染色
圖2 去細胞肌肉支架的病理圖片2A)。免疫組化染色顯示，BrdU陽性細胞數目多，提示支架中的人羊膜上皮細胞有增殖能力(圖2B)�？筃T3和BDNF染色顯示，支架中的人羊膜上皮細胞含有NT3、BDNF陽性顆粒，呈棕褐色分布在細胞質中(圖2C，2D)。JSM5600LV掃描電子顯微鏡顯示，在支架內部分布有大量細胞，細胞在支架中分布比較均勻，生長狀態(tài)良好(圖2E)。
3 討 論
理想的支架材料應與細胞外基質類似，與活體細胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去細胞肌肉作為治療神經損傷的生物工程支架材料有如下優(yōu)勢：(1)去細胞肌肉的細胞外基質成分對組織細胞的'遷移、黏附、生長代謝都有重要作用，研究表明再生的軸突可以很好的黏附在去細胞肌肉支架上〔9〕。(2)去細胞肌肉的排列結構與神經膜管類似,僅在直徑上略大于神經膜管〔10〕，它們提供了軸突可生長穿過的足夠空間〔9〕，該結構對于誘導神經軸突再生是十分重要的。 Fansa等比較了接種施萬細胞的不同去細胞生物材料(肌肉，靜脈，神經外膜)橋接缺損的外周神經的結果，發(fā)現缺乏神經膜管樣結構的去細胞肌肉支架(靜脈和神經外膜支架)中的再生軸突是無序和排列混亂的，而有神經膜管樣結構的去細胞肌肉支架中的再生軸突是有序排列的〔11〕。這種軸突再生的有序性對神經損傷的軸突再生同樣也是十分重要的。(3)去細胞肌肉引起的免疫排斥反應較小〔9，12〕。這些優(yōu)勢都說明去細胞肌肉可作為治療神經損傷的理想的材料。本研究采用的制作去細胞肌肉的方法主要用來減少異種移植材料的免疫排斥反應。該方法能有效的去除脂膜和膜相關抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留細胞外基質成分的原始空間結構。肌細胞正常呈平行分布，其細胞外基質成分也是平行分布的，從支架縱切面的結果看支架的纖維成分也是平行排布的，VG+ET染色結果顯示細胞外基質的主要成分膠原纖維和彈性纖維保持完好。這些結果進一步證實此方法可成功制備去細胞肌肉支架。
由于單獨應用去細胞肌肉支架治療神經系統(tǒng)疾病的效果有限〔13〕，去細胞肌肉的生物相容性也有待驗證。本研究用人羊膜上皮細胞作為種子細胞種入去細胞肌肉支架以探討其相容性。研究表明，羊膜上皮細胞中含有多種生物活性因子，包括黏蛋白、轉移生長因子、前列腺素E、表皮生長因子樣物質,IL1，IL8 等因子，另外，還可分泌BDNF和NT3等重要的神經營養(yǎng)因子〔4〕。其中層黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子對神經損傷的治療具有十分重要的作用。羊膜上皮細胞可作為一種較理想的種子細胞，與去細胞肌肉支架結合可能成為治療神經系統(tǒng)疾病的一個理想的組織工程材料。本實驗觀察到人羊膜上皮細胞在去細胞肌肉支架中分布均勻，抗BrdU、BDNF及NT3免疫組化顯示去細胞肌肉支架中羊膜上皮細胞有良好的增殖能力，并能表達BDNF和NT3，說明羊膜上皮細胞在去細胞肌肉支架中保持了良好的生物學活性。以上結果一方面證明了本研究制作的去細胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面為應用羊膜上皮細胞和去細胞肌肉支架結合治療神經系統(tǒng)疾病提供了理論和實驗基礎。
總之 ，本研究成功制備了去細胞肌肉支架，并證實人羊膜上皮細胞在去細胞肌肉支架中能分泌重要的神經營養(yǎng)因子，人羊膜上皮細胞與去細胞肌肉支架橋接體為神經缺損再生提供了基底膜、神經營養(yǎng)因子等種種有利因素，構成了良好的神經再生微環(huán)境，有利于使神經缺損得到較好地修復，為進一步研究羊膜上皮細胞與去細胞肌肉支架橋接體治療神經損傷奠定了一定的實驗基礎。
【參考文獻】
1 Mligiliche N，Kitada M，Ide C.Grafting of detergentdenatured skeletal muscles provides effective conduits for extension of regenerating axons in the rat sciatic nerve〔J〕.Arch Histol Cytol，2001;64 (1):2936.
2 Fansa H，Keilhoff G，Forster G,et al.Acellular muscle with Schwanncell implantation：an alternative biologic nerve conduit〔J〕.J Reconstr Microsurg,1999;15(7):5317.
3 Gulati AK，Rai DR，Ali AM.The influence of cultured Schwann cells on regeneration through acellular basal lamina grafts〔J〕.Brain Res，1995;705(12):11824.
4 朱 梅，陳 東，盂曉婷，等.羊膜上皮細胞移植治療帕金森病大鼠的實驗研究〔J〕.中國老年學雜志,2006;26(2)：2279.
5 Meng XT，Chen D，Dong ZY,et al.Enhanced neural differentiation of neural stem cells and neurite growth by amniotic epithelial cells coculture〔J〕.Cell Biol Intern，2007;31：6918.
6 Brown AL，BrookAllred TT，Waddell JE,et al.Bladder acellular matrix as a substrate for studying in vitro bladder smooth muscleurothelial cell interactions〔J〕.Biomaterials，2005;26：52943.
7 Suh JK，Matthew HW.Application of chitosanbased polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering：A review〔J〕.Biomaterials，2000;21(24)：258998.
8 Grande DA，Halberstadt C，Naughton G,et al.Evaluation of matrix scaffolds for tissue engineering of articular cartilage grafts〔J〕.J Biomed Mater Res，1997;34(2):21120.
9 Fansa H，Schneider W，Wolf G,et al.Host responses after acellular muscle basal lamina allografting used as a matrix for tissue engineered nerve grafts〔J〕.Transplantation,2002;74(3):3817.
10 李培建,胥少汀.去細胞肌肉支架移植及神經生長因子對脊髓橫斷性損傷的修復作用〔J〕.中國脊柱脊髓雜志，2000;10(4)：2203.
11 Fansa H，Keilhoff G.Comparison of different biogenic matrices seeded with cultured Schwann cells for bridging peripheral nerve defects〔J〕. Neurol Res,2004;26(2):16773.
12 Brown AL，Farhat W，Merguerian PA,et al.22 week assessment of bladder acellular matrix as a bladder augmentation material in a porcine model〔J〕.Biomaterials,2002;23：217990.
13 李培建，李兵倉，胥少汀.肌基膜管移植修復脊髓缺損的實驗研究〔J〕.中華創(chuàng)傷雜志,2001;17(9)：5258.
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