組織芯片的手工制作技術(shù)及其應(yīng)用

組織芯片的手工制作技術(shù)及其應(yīng)用

                             作者：朱玉紅 呂增華 張祥盛

【關(guān)鍵詞】  手工組織芯片；芯片；HE染色；免疫組化染色
　　組織芯片又稱組織微陣列，是將數(shù)十個、數(shù)百個乃至數(shù)千個小的組織片整齊地排列在某一載體上（通常是載玻片）而成的微縮組織切片［1］。該切片體積小，信息含量大，可以進(jìn)行HE染色、特殊染色、免疫組織化學(xué)染色和原位雜交等，一次實(shí)驗(yàn)即可獲得大量信息，大大節(jié)約了組織原材料和檢測試劑，減少了實(shí)驗(yàn)誤差，增強(qiáng)了可比性，操作簡便［2］。但組織芯片制作技術(shù)一般采用進(jìn)口的組織微陣列儀或組織芯片制作機(jī)，這些儀器價格昂貴，不適于基層單位使用。為此我們嘗試手工方法制作組織芯片，并取得了較好的效果�，F(xiàn)介紹如下。
　　1  材料與方法
　　1?1  標(biāo)本來源  收集2004年1月—2005年10月間我院胸外科送檢的肺腫瘤組織石蠟標(biāo)本106例，其中腺癌36例，鱗癌30例，小細(xì)胞癌30例，瘤旁正常肺組織10例。
　　1?2  方法
　　1?2?1  組織處理：所有標(biāo)本經(jīng)4%的甲醛固定，正常組織處理，石蠟包埋，并常規(guī)切片HE染色。
　　1?2?2  組織芯片的基本制作過程：①自制打孔針和取樣針：60 ml注射器針頭2個，其內(nèi)徑為1.5 mm，分別用于打孔和穿取組織。介入治療科用穿刺針1個，其內(nèi)徑1?4 mm 。用鋸片將3個針末端的針尖鋸成平端，且使穿刺針比注射器針略長1~2 mm并將其末端磨圓，便于鉆取蠟塊后將注射器針內(nèi)的蠟芯完整推出。②收集和選擇病例：首先應(yīng)根據(jù)已有研究課題收集和選擇病例。復(fù)查組織切片，審查病理診斷，標(biāo)記組織中的靶點(diǎn)(即欲取組織點(diǎn))并在切片上面畫圈標(biāo)記。選擇相應(yīng)組織蠟塊(稱為供體蠟塊donor)標(biāo)記相應(yīng)靶點(diǎn)并畫圈。③受體蠟塊的制作：將56~58℃石蠟(上海華靈公司產(chǎn)品)經(jīng)多次反復(fù)溶化后過濾，注入模具內(nèi)，制成空白蠟塊，選用模具大小可根據(jù)打孔的多少而定。打孔前先用載玻片在受體蠟塊表面劃定界限，根據(jù)樣本多少決定打孔數(shù)目和區(qū)域，并用直尺劃出網(wǎng)格線。④組織蠟芯的獲得與植入：將供體蠟塊組織面朝下放入45℃恒溫水浴鍋中1 min，組織塊受熱不僅易于鉆取且不會破壞其周圍組織，最大程度減少對供體蠟塊的破壞，用另一打洞針在蠟塊的標(biāo)記部位打洞采集組織芯。組織芯推出后，直接插入或用鑷子小心夾取插入受體蠟塊的空洞內(nèi)。有時因?yàn)闃?biāo)本的原因，鉆取的組織蠟芯僅部分有組織、部分為空白時，可以在毗鄰處重復(fù)鉆取，切除空白部分，將前半截有組織蠟芯裝入孔內(nèi)，用穿刺針針芯送入底部后再裝入另一個有組織的半截蠟芯，并用針芯適當(dāng)填搗，兩截間不留間隙，以保證切片時每一孔標(biāo)本都能切到。⑤組織芯片的表面平整：在微陣列排好以后，可以發(fā)現(xiàn)樣本高低不平，此時可以將受體石蠟塊放在60 ℃的烤箱中10~15 min，然后用一個載玻片下壓平整，注意要均勻下壓［3］。⑥ 受體蠟塊與組織蠟芯的融合：將做好的蠟塊有組織的一面朝下放入模具內(nèi)，置入60 ℃烤箱內(nèi)1 h，使兩者重新溶為一體，在這個過程中，每10 min觀察一次，既要保證組織芯和蠟融合在一起，又要防止TMA蠟塊完全溶解、組織排列混亂而無法使用。組織芯和蠟融合好后輕輕地從烤箱中取出模具,讓半融狀態(tài)的石蠟在室溫條件下冷卻約30 min，再放入冰箱冷凍后,將組織芯片蠟塊從模具中取出，至此，組織芯片蠟塊便制做成功。⑦切片 ：修正蠟塊，用冰塊冰組織面，連續(xù)5 μm厚切片，40 ℃溫控漂烘儀裱片，用于免疫組化染色的組織切片裱于經(jīng)多聚賴氨酸溶液處理的載玻片上，56 ℃烤片3 h后移至37 ℃恒溫箱中過夜。
　　1?2?3  免疫組織化學(xué)染色：對已制作好的組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，采用即用型ElivisionTM plus法，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)高壓煮沸抗原修復(fù)，PBS緩沖液沖洗，一抗4℃冰箱過夜。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，選用的抗體有MMP?9、Ki67、PCNA、CD147、VEGF等。以上試劑均由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供。
　　2  結(jié)果
　　2?1  組織芯片的質(zhì)量  本實(shí)驗(yàn)2個組織芯蠟塊共切片10張，載玻片上組織陣列整齊，530個微組織塊有8塊脫失，3塊組織有部分折疊，其余組織形態(tài)保存完好。
　　2?2  免疫組織化學(xué)染色  Ki67、PCNA陽性反應(yīng)呈棕黃色，定位于細(xì)胞核上；MMP?9、CD147、VEGF陽性反應(yīng)定位于細(xì)胞漿，顯色清晰，背景干凈。3  討論
　　
　　組織芯片容納的信息量大，一張玻片可排列數(shù)十到上千個樣本，一次完成實(shí)驗(yàn)，既省時、省力、節(jié)約試劑，又減少了實(shí)驗(yàn)誤差，增加了結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和可靠性。我們用手工方法制作組織芯片，只需60 ml注射器針頭和介入治療科廢舊穿刺針，工具簡單，適于在基層院應(yīng)用。 組織芯片制作過程中最常見的現(xiàn)象是目標(biāo)蠟塊損壞、無效組織、組織缺失、折疊、移位和飄散。為此，應(yīng)注意以下幾個問題：①對目標(biāo)蠟塊的保護(hù)：在微陣列蠟塊的制作中，由于要從目標(biāo)蠟塊中鉆取組織，在鉆取中不可用力過猛，應(yīng)當(dāng)勻速鉆取，也可以把蠟塊放入45~50 ℃的熱水中浸泡數(shù)秒鐘再鉆取目標(biāo)組織,這樣可防止損傷組織，鉆取組織結(jié)束后,為了保護(hù)蠟塊可將鉆孔用蠟密封。②用針直接在冷卻后的蠟塊上打孔不容易成功，因?yàn)楹苋菀资瓜瀴K碎裂或造成相鄰孔的貫通。實(shí)踐中我們發(fā)現(xiàn)對于熔點(diǎn)為58 ℃的石蠟，置于45 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)2 min左右，在蠟塊微微變軟時打孔效果好。③供體蠟塊的厚度及其制作過程直接影響到芯片的質(zhì)量。由于存檔蠟塊經(jīng)反復(fù)使用，組織厚薄不一，組織芯易出現(xiàn)漏取或深淺不一，另存檔蠟塊的制作不盡相同，質(zhì)量參差不齊，從而降低了組織芯片的利用率。所以在平時工作中應(yīng)嚴(yán)格按照操作指南進(jìn)行，臨床組織標(biāo)本的制作或針對組織芯片構(gòu)建的需要，專門留取相應(yīng)組織，將組織取材為1.5 cm×1.0 cm×0.4 cm，手工脫水、透明、包埋,保證供體蠟塊的質(zhì)量。④無效組織的處理：所謂無效組織包括以下兩種：一是指在目標(biāo)蠟塊中定位不準(zhǔn)確，未取到目標(biāo)組織。避免的辦法是病理診斷醫(yī)師負(fù)責(zé)切片的診斷，準(zhǔn)確找出所需區(qū)域并作出相應(yīng)標(biāo)記；病理技術(shù)人員熟練掌握芯片制作方法，病理診斷醫(yī)師與病理技術(shù)人員密切合作是避免無效組織的關(guān)鍵。二是組織厚度不夠，在HE切片下有所需組織，但由于組織太薄，再修整后已沒有所需組織，避免的辦法是盡可能選擇組織塊較厚的蠟塊，或針對組織芯片構(gòu)建的需要，取材時留取相應(yīng)組織。⑤組織切片時，為減少多次修塊而造成的組織損耗和浪費(fèi)，要一次多切片直至將組織切完。5 μm厚的芯片，可一次切片100~200張，切片可保存于-20℃~-40℃冰箱中備用。如需較長時間保存，則可用少量融化的石蠟滴封每張切片后-20℃保存，染色時可適當(dāng)延長脫蠟時間，18個月內(nèi)未見對免疫組化或原位雜交結(jié)果有任何負(fù)面影響［4］。⑥漂片時可將切片先漂在涼水中，讓其自然展開，然后轉(zhuǎn)移至45 ℃溫水中漂片，再貼于涂有多聚賴氨酸的玻片上。漂片水溫要適宜，溫度過高組織片易離散，溫度過低則難以保證組織片的充分展開。文獻(xiàn)報(bào)道的膠帶粘貼紫外線轉(zhuǎn)移法可以有效地避免組織移位和脫落［5］，但該方法膠帶從玻片上分離時很困難，同時常常會帶一部分組織下來，價格昂貴又費(fèi)時，不適用于基層醫(yī)院。⑦因考慮到一些細(xì)胞尤其是腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性問題，為使挖取組織塊能更全面的代表原組織蠟塊的結(jié)構(gòu)，并保持組織完整性，我們采取了直徑1.5 mm組織樣本，理論上可包含4 000~20 000個細(xì)胞，足以反映原組織結(jié)構(gòu)的信息。本實(shí)驗(yàn)我們嘗試將組織芯片技術(shù)應(yīng)用在免疫組織化學(xué)染色上，將106例肺組織標(biāo)本做成2個組織芯蠟塊，通過一次免疫組織化學(xué)染色即完成。充分體現(xiàn)了其高效、快速、低消耗、實(shí)驗(yàn)誤差小和可比性強(qiáng)的特點(diǎn)�？傊�，組織芯片技術(shù)還處在不斷完善的過程中，在實(shí)際工作中我們要不斷的總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，改進(jìn)制作技術(shù)，將組織標(biāo)本的消耗降到最低，從而提高組織芯片的利用率，拓寬組織芯片的應(yīng)用范圍。
 
【參考文獻(xiàn)】
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