平貝母內(nèi)生真菌的分離及其生物堿產(chǎn)生能力的初步研究

平貝母內(nèi)生真菌的分離及其生物堿產(chǎn)生能力的初步研究

平貝母內(nèi)生真菌的分離及其生物堿產(chǎn)生能力的初步研究 ［摘要］ 目的 從平貝母植株中分離內(nèi)生真菌，從中篩選可以產(chǎn)生與貝母藥材相同或相似生物堿的菌株。方法 以平貝母幼嫩植株為材料，用常規(guī)微生物學(xué)方法分離出其中的內(nèi)生真菌。以碘化鉍鉀試劑、碘-碘化鉀試劑和碘化汞鉀試劑分別對(duì)這些真菌的提取物進(jìn)行生物堿定性檢測(cè)；再對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行TLC分析，并與藥材提取物進(jìn)行比較。結(jié)果 從平貝母幼苗中共分離出9種內(nèi)生真菌，其中一種（Fu7）在3種生物堿定性反應(yīng)中都呈陽(yáng)性，其菌絲提取物經(jīng)薄層層析后，出現(xiàn)兩個(gè)與藥材樣品有相同Rf值的斑點(diǎn)。結(jié)論 該內(nèi)生真菌菌株應(yīng)具有產(chǎn)生貝母生物堿的能力。

　�。坳P(guān)鍵詞］ 平貝母；內(nèi)生真菌；生物堿

平貝母（Fritillaria ussuriensis）為常用中藥材，其中的貝母堿類(lèi)化合物有清熱潤(rùn)肺、止咳化痰等功效。由于對(duì)其需求量大，而且植株生長(zhǎng)緩慢，野生資源人為破壞嚴(yán)重，自1987年起便被《中國(guó)珍稀瀕危保護(hù)植物名錄》列為漸危種［1］。植物內(nèi)生真菌是指生活在植物體內(nèi)或生活史的一定階段處于植物體內(nèi)的真菌，它們?cè)谥参矬w內(nèi)的存在具有一定的普遍性，其中一部分可能產(chǎn)生一些與其宿主相同或相似的生理活性成分，包括治療人類(lèi)疾病的藥物［2，3］。因此，如果能從貝母中分離出可以產(chǎn)生貝母堿類(lèi)生物堿的內(nèi)生真菌，就有可能采用工業(yè)發(fā)酵的方法生產(chǎn)其藥用成分，這樣不僅可以改善目前該藥材緊缺的狀況，還有利于保護(hù)這種珍貴的藥用植物資源。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　平貝母引種自吉林市左家中國(guó)特產(chǎn)所，栽種于西北大學(xué)校園生物實(shí)驗(yàn)地，春季取整株幼苗作為分離內(nèi)生真菌的實(shí)驗(yàn)材料。平貝母藥材（干燥鱗莖）購(gòu)自中藥店。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1 內(nèi)生真菌的分離

　　用自來(lái)水洗凈幼苗上的泥土，在75%酒精中迅速漂洗一下，無(wú)菌水沖洗后移入5%的次氯酸鈉溶液中浸泡8 min，最后用無(wú)菌水洗3~5遍。將幼苗切成小段，接種到馬丁培養(yǎng)基平板上，置25 ℃條件下培養(yǎng)，切斷邊緣長(zhǎng)出菌絲后，按常規(guī)方法進(jìn)行分離、純化后轉(zhuǎn)接到PDA斜面上備用。

　　1.2.2 培養(yǎng)

　　將在PDA平板上培養(yǎng)的旺盛生長(zhǎng)的各菌株菌絲體制成懸液，分別等量接種于裝有50 ml馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每種接5瓶。置往復(fù)式搖床上25 ℃條件下培養(yǎng)，震蕩速度約100次/min。培養(yǎng)5~7天后，將各待測(cè)培養(yǎng)物中的菌絲體和培養(yǎng)液過(guò)濾分開(kāi)，菌絲體在60 ℃下烘干備用，濾出的培養(yǎng)液直接用于生物堿的定性檢測(cè)。

　　1.2.3 樣品檢測(cè)

　　將上述各種菌絲體研碎，分別用80％酒精熱提2次，蒸去酒精，濃縮液滴加5%鹽酸使成酸性，過(guò)濾［4］，即為用于生物堿定性檢測(cè)的提取液。

取各樣品的菌絲體提取液和培養(yǎng)液少量，分別滴加1~2滴以下3種試劑：（1）碘化鉍鉀試劑（Dragendorff’s reagent），若產(chǎn)生黃至桔紅色沉淀則為陽(yáng)性反應(yīng)；（2）碘-碘化鉀試劑，若產(chǎn)生棕色或褐色沉淀為正反應(yīng)；（3）碘化汞鉀試劑（Mayer’s reagent），生成類(lèi)白色沉淀者為正反應(yīng)［5］。

選取上述檢測(cè)呈陽(yáng)性的真菌進(jìn)一步進(jìn)行薄層層析（TLC）分析。將干燥的平貝母藥材粉碎，過(guò)60目篩作為對(duì)照品，與待測(cè)菌絲體都于60 ℃烘箱中烘至恒重，按文獻(xiàn)6方法制備樣品［6］。將對(duì)照品和樣品提取液都點(diǎn)樣于硅膠G薄板，采用環(huán)己烷-醋酸乙酯-二乙胺（6∶4∶1）作為展開(kāi)劑，改良碘化鉍鉀試劑為顯色劑，進(jìn)行TLC檢測(cè)。

　　2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

從平貝母幼苗中共分離出9種內(nèi)生真菌，分別以Fu1~Fu9表示之。培養(yǎng)液的3種定性反應(yīng)除少數(shù)為不確定結(jié)果外，均為陰性反應(yīng)，說(shuō)明其中不含生物堿或生物堿濃度很低。菌絲體提取液的定性反應(yīng)結(jié)果如表1所示。表1 各種內(nèi)生真菌菌絲體提取液的定性反應(yīng)結(jié)果（略）

從表1中可以看出：Fu7菌株的菌絲體提取液在上述3種定性反應(yīng)中都呈明確陽(yáng)性，說(shuō)明它具有產(chǎn)生生物堿的能力，因此將其進(jìn)行進(jìn)一步的TLC檢測(cè)，結(jié)果藥材對(duì)照樣品有3個(gè)斑點(diǎn)出現(xiàn)，說(shuō)明其中至少含有3種生物堿；而所測(cè)Fu7樣品出現(xiàn)2個(gè)斑點(diǎn)，且它們的Rf值與藥材提取物中的兩個(gè)點(diǎn)基本相同。因此，樣品中應(yīng)該含有與平貝母中相同或相似的生物堿，對(duì)該菌我們還將進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

　�。蹍⒖嘉墨I(xiàn)］

　　1 國(guó)家環(huán)境保護(hù)局，中國(guó)科學(xué)院植物研究所.中國(guó)珍稀瀕危植物名錄.北京：科學(xué)出版社，1987，197-200.

　　2 郭良棟.內(nèi)生真菌研究進(jìn)展.菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：148-152.

　　3 劉蕓，殷紅，彭輝，等.植物內(nèi)生真菌—潛在的天然藥物新來(lái)源.中華現(xiàn)代中西醫(yī)雜志，2005，3（5）：404-405.

　　4 上海藥物研究所.中草藥有效成分的提取和分離.上海：上海人民出版社，1972，179-180.

　　5 陳業(yè)高.植物化學(xué)成分.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004，275.

　　6 趙得永.4種川貝母的總皂甙、總生物堿及西貝素的含量測(cè)定.中國(guó)中藥雜志，1994，19（2）：71-73.

　　作者單位： 710069 陜西西安，西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

　�。壅�要］ 目的 從平貝母植株中分離內(nèi)生真菌，從中篩選可以產(chǎn)生與貝母藥材相同或相似生物堿的菌株。方法 以平貝母幼嫩植株為材料，用常規(guī)微生物學(xué)方法分離出其中的內(nèi)生真菌。以碘化鉍鉀試劑、碘-碘化鉀試劑和碘化汞鉀試劑分別對(duì)這些真菌的提取物進(jìn)行生物堿定性檢測(cè)；再對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行TLC分析，并與藥材提取物進(jìn)行比較。結(jié)果 從平貝母幼苗中共分離出9種內(nèi)生真菌，其中一種（Fu7）在3種生物堿定性反應(yīng)中都呈陽(yáng)性，其菌絲提取物經(jīng)薄層層析后，出現(xiàn)兩個(gè)與藥材樣品有相同Rf值的斑點(diǎn)。結(jié)論 該內(nèi)生真菌菌株應(yīng)具有產(chǎn)生貝母生物堿的能力。

下一頁(yè)

【平貝母內(nèi)生真菌的分離及其生物堿產(chǎn)生能力的初步研究】相關(guān)文章：

論文寫(xiě)作及其研究的特點(diǎn)06-19

公路路面裂縫產(chǎn)生原因及治理對(duì)策研究05-25

文化創(chuàng)意產(chǎn)業(yè)及其評(píng)估實(shí)踐研究05-30

OFDM技術(shù)研究及其系統(tǒng)仿真05-11

提高港口設(shè)備綜合管理能力的研究08-26

現(xiàn)代中小企業(yè)招聘現(xiàn)狀及其對(duì)策研究06-12

談向家山滑坡成因分析及其綜合治理研究08-04

民事權(quán)利能力若干題目研究06-08

談智能決策支持系統(tǒng)及其在林業(yè)中的應(yīng)用研究08-21

研究生開(kāi)題報(bào)告06-29