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有關(guān)藥物對(duì)腎小球抑制作用的對(duì)比分析
摘要：采用體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞技術(shù)，觀察具有降逆泄?jié)�、益氣活血功效的中藥腎康注射液及苯那普利對(duì)ECM不同成分的影響。腎康注射液具有抑制ECM成分中纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)和Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)的作用，該抑制作用具有一定的量效關(guān)系。苯那普利對(duì)ECM中FN、Col Ⅳ也有一定的抑制作用，但不及腎康注射液作用明顯。結(jié)論，腎康注射液對(duì)ECM的抑制作用優(yōu)于苯那普利。關(guān)鍵詞：腎小球 藥物 作用 對(duì)比
近年來(lái)，隨著對(duì)腎小球硬化機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入，腎小球系膜細(xì)胞(MC)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及各種細(xì)胞因子在腎功能進(jìn)行性減退過(guò)程中所起的作用倍受關(guān)注。抑制MC增殖，減少ECM的堆積，拮抗細(xì)胞因子的不良作用，已成為防治腎小球硬化，延緩CRF病情進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。
一、對(duì)比研究使用的材料
選用的材料
1、腎組織來(lái)源系我校附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科孕5月引產(chǎn)胎腎。
2、藥物與試劑腎康注射液(SKI)由大黃、丹參、紅花等組成，成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，每毫升含原生藥0.3g；苯那普利(Benayzepril)由瑞士諾華制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：012200；V型膠原酶、HEPES均系Sigma產(chǎn)品；RPMI 1640、胰蛋白酶、胰島素均為美國(guó)GIBCO產(chǎn)品；小鼠抗人單克隆FN抗體、兔抗人FN多抗、羊抗兔IgG-HRP均購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司；LN、Col Ⅳ放射免疫分析試劑盒，均購(gòu)于上海海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)中心。
3、主要儀器CO2孵箱(TYPE4型)德國(guó)HERAEUS公司生產(chǎn)；倒置顯微鏡(TOKYO)日本OLYMPUS公司生產(chǎn)；潔凈工作臺(tái)(月壇牌)北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠(chǎng)生產(chǎn)；酶標(biāo)分析儀(MODEL2550)美國(guó)BTO-RAD公司生產(chǎn)；FT-613自動(dòng)計(jì)數(shù)125 I放免測(cè)量?jī)x，北京核儀器廠(chǎng)生產(chǎn)。
二、研究采用的方法
1、MC培養(yǎng)與鑒定無(wú)菌取胎腎，分離提取腎皮質(zhì)小球組織，按照于力方等方法(1)取去掉包囊的單個(gè)腎小球進(jìn)行原代和繼代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)中使用傳代5代的MC。培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)免疫病理鑒定證實(shí)為單純的MC，無(wú)上皮細(xì)胞、腎小管細(xì)胞及成纖維細(xì)胞污染。
2、分組及MC上清的收集吸取培養(yǎng)的第5代MC培養(yǎng)瓶中液體，加胰酶1ml，置孵箱(5%CO2、37℃)中消化3min，加10% FCS 1640終止液2ml，抽吸于離心管中，800rpm，離心3min，棄上清，加15% FCS 1640培養(yǎng)液于離心管中，吹打，混勻。用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，傾入加樣槽中，用8導(dǎo)加樣槍?zhuān)疵靠?00μl，密度4000/孔鋪板。將96孔板按列從左至右依次分為空白對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng)組Ⅰ)、苯那普利組(簡(jiǎn)稱(chēng)組Ⅱ)、腎康注射液高濃度組1、2(簡(jiǎn)稱(chēng)組Ⅲ、組Ⅳ)、腎康注射液中濃度組1、2(簡(jiǎn)稱(chēng)組Ⅴ、組Ⅵ)、腎康注射液低濃度組1、2(簡(jiǎn)稱(chēng)組Ⅶ、組Ⅷ)，共8組(列)，每列6孔，待細(xì)胞貼壁24h后，每孔加無(wú)血清1640培養(yǎng)液200μl同步24h。除空白對(duì)照組外，其余各組分別依次加入苯那普利10－3mmol/L及腎康注射液100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/ml，待刺激48h后依次收集上清待測(cè)。
3、測(cè)定ECM中FN的含量用雙抗體夾心ELISA法，0.5mg/ml鼠 抗人FN抗體原液用包被緩沖液稀釋1000倍。取96孔板，50μl/孔鋪板，4℃過(guò)夜，甩去。用PBS－吐溫20洗滌液洗板3次，每次3min，間隔2min，控干。每孔加1%BSA封閉液100μl，37℃，1h后甩去，控干。依次按組各孔分別加入待測(cè)上清50μl，37℃，3h后甩去，洗板4次后，加兔抗人FN抗血清(原液用0.1% BSA·PBS1∶1000稀釋)50μl/孔，室溫放置60min。加HRP羊抗兔IgG(用0.1% BSA·PBS1∶1000稀釋)50μl/孔，室溫放置50min。再洗板4次后，每孔加入OPD顯色液50μl，預(yù)熱酶標(biāo)儀，用2M H2SO4終止液50μl/孔終止，立即在492nm波長(zhǎng)讀數(shù)，并記錄OD值。
4、ECM中LN、Col Ⅳ含量的放射免疫法(RIA)測(cè)定采用競(jìng)爭(zhēng)法，將緩沖液稀釋10倍，分別將125 I－LN、抗LN血清、125 I－ColⅣ、抗ColⅣ血清及二抗用緩沖液稀釋?zhuān)瑢⒋郎y(cè)上清分別與125 I－LN、125 I－ColⅣ及相應(yīng)的抗血清混勻，4℃過(guò)夜反應(yīng)，加二抗4℃反應(yīng)60min，離心3500r/min 10min棄上清，125 I放射免疫測(cè)量?jī)x計(jì)數(shù)。
5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均采用SDAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果用(±s)表示。
三、研究的結(jié)果
腎康注射液與苯那普利對(duì)ECM成分含量的影響，在對(duì)ECM中FN含量影響方面，腎康注射液組(Ⅲ～Ⅶ組)與空白對(duì)照組(Ⅰ組)相比，均有顯著性差異(P＜0.05～0.01)；說(shuō)明腎康注射液除低濃度組2(Ⅷ組)外，其余各組對(duì)FN均有明顯的抑制作用，而且隨著濃度的遞增此作用更加明顯，并表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)腎康注射液即使在極小濃度時(shí)對(duì)ECM中LN及Col Ⅳ的含量也有明顯的抑制作用，該抑制作用也呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。苯那普利組(Ⅱ組)在對(duì)FN、Col Ⅳ含量影響方面，與空白對(duì)照組相比也有顯著性差異(P＜0.01～0.05)；但對(duì)LN影響方面，兩者比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；說(shuō)明苯那普利對(duì)ECM中FN、Col Ⅳ也有一定的抑制作用，但對(duì)LN其抑制作用不明顯。另外，從表中還可看出，腎康注射液各濃度組(Ⅲ～Ⅷ組)與苯那普利組相比，在抑制LN方面也均有極顯著性差異(P＜0.01)；除腎康注射液低濃度組2(Ⅷ組)外，其余各組與苯那普利組相比，在抑制Col Ⅳ方面也有顯著性差異(P＜0.01～0.05)；腎康注射液高濃度組(Ⅲ組)與苯那普利組相比，在抑制FN方面也有顯著性差異(P＜0.05)；說(shuō)明腎康注射液在抑制ECM中FN、LN、Col Ⅳ含量方面優(yōu)于苯那普利。
四、討論
腎小球硬化時(shí)ECM的改變是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外腎臟病學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一，ECM在腎小球內(nèi)的蓄積，是腎小球硬化的主要特征性變化。
苯那普利是第四代血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)�，F(xiàn)已證實(shí)，腎臟具有獨(dú)立的腎素－血管緊張素系統(tǒng)(RAS)，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是該系統(tǒng)最具有生物活性的因子。目前研究證實(shí)AngⅡ受體(ATR)至少有Ⅰ和Ⅱ兩種亞型，其中Ⅰ型受體(ATR1)意義最大。該受體分布在腎小球MC上，與AngⅡ、AngⅢ有高度的親和力。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)ATR1占腎內(nèi)ATR亞型分布的90%以上，Osborne等在10余年前就報(bào)道動(dòng)脈內(nèi)注射3H標(biāo)記的AngⅡ，發(fā)現(xiàn)3H-Ang Ⅱ只結(jié)合在腎小球系膜區(qū)，而不與腎血管、腎小管等部位結(jié)合。用125 I-AngⅡ進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)光鏡下125 I-AngⅡ
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