響應面法優化耐有機溶劑脂肪酶營養條件

響應面法優化耐有機溶劑脂肪酶營養條件

　　摘要：本文以響應面法對蠟狀芽孢桿菌SWWL6 液體發酵產酶的營養條件進行優化。經單因素實驗確定發酵產酶的最佳碳源、氮源及無機鹽分別為可溶性淀粉、酵母膏、NH4NO3、MgSO4? 7H20 和NaCl。采用部分因子分析法研究初始發酵培養基各種組分對產酶的影響程度，發現酵母膏、NH4NO3 的質量濃度對產酶的影響顯著。通過最陡爬坡實驗逼近最大響應區域。中心組合設計和響應面分析法確定最優培養基組成為酵母膏0.64%、NH4NO3 0.384%、可溶性淀粉1%、MgSO4? 7H20 0.1%，NaCl 0.25%，甲苯20%。優化后相對酶活比優化前的提高了3.48 倍。
　　
　　關鍵詞：耐有機溶劑；脂肪酶；響應面法；蠟狀芽孢桿菌
　　
　　0 引言
　　
　　脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一類重要的甘油酯鍵水解酶，可以在油水界面上催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油。在特定的非水相系統中，還可催化水解反應的逆反應，以及酯化合成和轉酯反應。從催化特性來看，脂肪酶具有化學選擇性、高度的立體異構專一性、不需輔酶、高效、反應條件溫和、無毒、副產物少等優點。近年來，隨著非水相酶學的不斷深入，脂肪酶的應用已超出了水相中水解反應的范圍，被廣泛應用于有機相中酯的合成、手性化合物的拆分、高聚物的合成、肽合成、生物柴油的合成等方面，具有廣闊的應用前景。有機合成大多數是在有機介質中進行的，而有機溶劑則易引起蛋白質的變性，使酶失活，因此限制了酶在有機合成中的應用[1]。如果一種脂肪酶能在高濃度的有機溶劑中具有穩定性，就能很好的解決催化環境受限的問題，使酶的催化反應更容易化，同時降低了酶的生產成本。
　　因此耐有機溶劑脂肪酶的研究具有非常重要的意義。目前，關于耐有機溶劑脂肪酶的研究多見于國外報道，日本的Ogino H 等人篩選到有機溶劑耐受菌Psudomonas aeruginosaLST-03[2]。國內鮮見報道，尤其是關于蠟狀芽孢桿菌脂肪酶還沒有見到報道。
　　隨著計算方法的完善和微機應用的普及，響應面方法已被成功應用于科學研究的許多領域[3、4]。它是一種優化工藝條件的有效方法[5]，采用更為合理的試驗設計，能以最經濟的方式對試驗進行全面研究。該方法已被廣泛地用于同時存在多因素影響的實驗優化上。本文結合了單因素實驗、部分因子實驗、響應面法對Bacillus cereus SWWL6 發酵培養基進行了優化，從而提高脂肪酶的產量，為耐有機溶劑脂肪酶的進一步分離純化、酶學性質及應用研究奠定了基礎。
　　
　　1 材料與方法
　　
　　1.1 試驗菌株蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）SWWL6 吉林農業大學生命科學學院生物工程研究室保藏菌株。
　　
　　1.2 培養基及培養條件斜面培養基：橄欖油0.1%，蛋白胨1%，酵母浸膏0.5%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH 7.0種子培養基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母粉0.2%，pH 7.0發酵培養基：橄欖油1%，酵母浸膏0.5%，MgSO4·7H20 0.1%，NaCl 0.25%,甲苯20%，pH 7.0將斜面活化后的菌種接至裝有50mL 種子培養基的250mL 三角瓶，30℃，150r/min 培養24h，制得種子液。以5％接種量轉接到裝有40 mL 發酵液的250 mL 三角瓶中，30℃，150r/min 條件下培養48h。發酵液于8000r／min 離心15min，取上清液測定酶活力[6、7]。
　　
　　1.3 酶活力測定方法脂肪酶的活力測定采用分光光度計法[8]。在刻度試管中加入1mM p-NPP 溶液lmL 和50mM Tris-HCL 緩沖液(pH8.0)lmL，兩者充分混勻后于38℃水浴中保溫5min，向測定管加入適當稀釋的待測酶液0.1mL，以加熱滅活的待測酶液作為空白對照,反應15min 后快速取出，定容至7.5mL 于分光光度計4l0nm 下測定酶催化產生的對硝基苯酚（pNP）的吸光值。脂肪酶 1 個酶活力單位的定義(U)：在上述條件下，每分鐘水解p-NPP 產生1μmol 對硝基苯酚(pNP)所需的酶量。
　　
　　1.4 單因素實驗
　　1.4.1 最適碳源篩選分別以 1%的葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、橄欖油+葡萄糖（3：2）代替初始發酵培養基的碳源，其他成分不變，配制成不同碳源的產酶培養基，發酵后進行酶活測定。以初始培養基中橄欖油的酶活為100%[10]。
　　1.4.2 最適氮源篩選以可溶性淀粉作為碳源，0.5%的酵母膏、酵母膏+蛋白胨（3：2）、蛋白胨、牛肉膏、尿素、NH4NO3、(NH4)2SO4 七種有機氮源和無機氮源進行最佳氮源的篩選。以初始培養基中酵母膏的酶活作為100%。
　　1.4.3 最適無機鹽的篩選以可溶性淀粉為碳源，酵母膏和NH4NO3 為復合氮源，分別以0.5%的K2HPO4、0.1%的MgSO4·7H20、0.25%和0.5%的NaCl 作為無機鹽進行篩選。以K2HPO4 的酶活為100%。
　　
　　1.5 實驗設計
　　1.5.1 部分因子實驗設計(Fractional Factorial Design, FFD)蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）SWWL6 菌株產脂肪酶的發酵培養基成分主要有可溶性淀粉、酵母膏、NH4NO3、MgSO4·7H20、NaCl 和甲苯，采用6 因素2 水平的1/8 部分因子實驗設計，實驗次數為8。擬合出線性方程：
　　Y = a0 + a1X1 + a2X2 + a3X3 + a4X4 + a5X5 + a6X6 (1)式中：X1、X2、X3、X4、X5、X6 分別為可溶性淀粉、酵母膏、NH4NO3、MgSO4·7H20、NaCl 和甲苯的質量濃度(g/100mL)，Y 為相對酶活力(%)，a0、a1、a2、a3、a4、a5、a6 為方程系數。
　　1.5.2 最陡爬坡實驗設計根據部分因子實驗的實驗結果,以擬合的一階模型回歸系數的符號和大小來設計顯著因素的最陡爬坡方向及步長，通過使主要因素同時朝響應值增大的方向變化, 進行最陡爬坡實驗設計，找出峰值, 從而逼近最大響應區域。
　　1.5.3 中心組合實驗設計(Central Composite Design,CCD)[9]
　　以相對酶活作為響應值，采用2 因素5 水平的中心組合設計對影響SWWL6 發酵產酶的2 個主要影響因素(酵母膏、NH4NO3)進行響應面優化，5 水平的設計,其中中心點取最陡爬坡實驗最大響應值時的水平值。
　　擬合出一個二次多項式方程。該方程為描述響應變量與自變量的經驗模型。對于2 因子系統，模型可述為：
　　Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b11X1X1+ b12X1X2 + b22X2X2 （2）式中： X1、X2 為部分因子實驗確定對響應值影響顯著的2 種培養基組分的質量濃度(g/100mL)，Y 為預測響應值，即相對酶活(%)： b0、b1、b2、b11、b12、b22 為方程系數。用MINITAB 軟件對實驗進行回歸分析，其中回歸系數的顯著性用t 檢驗，數學模型方程的顯著性用F(Fischer)檢驗評價，方程的擬合性由確定系數R2 確定。
　　
　　1.6 模型驗證對該多元函數進行簡單的性狀分析便可確定出其極值點以及取得極值的相應的自變量的取值。再按照計算所得到的參數進行實驗，以驗證模型的可靠性，并確定最后的優化結果。
　　
　　2 結果與討論
　　
　　2.1 不同碳源對發酵產酶的影響按照 1.4.1 的方法進行碳源篩選，結果如圖1 所示：由圖 1 可知，在供試的六種碳源中，產生耐有機溶劑脂肪酶相對酶活力依次為可溶性淀粉＞橄欖油+葡萄糖＞橄欖油＞麥芽糖＞葡萄糖＞蔗糖�？扇苄缘矸鄣男Ч�明顯優于其它單一組分的碳源，故選可溶性淀粉為發酵最適碳源。
　　
　　2.2 最佳氮源的選擇按照 1.4.2 的方法進行最佳氮源的選擇，實驗結果如所示：顯示的結果明，有機氮源中以酵母膏的產酶效果最佳，無機氮源以NH4NO3 產酶最佳，大多數微生物更傾向利用有機和無機復合氮源，對酵母膏和NH4NO3 組成的復合氮源進行了考察，效果優于單一的無機或有機氮源，因此選用酵母膏和NH4NO3 組成復合氮源。
　　
　　2.3 無機鹽的選擇按照 1.4.3 的方法進行無機鹽的選擇，實驗結果如所示：無機鹽組分中，0.1% MgSO4·7H20 和0.25% NaCl 對產酶有明顯的促進作用，Sharma[11]等報道,往培養基中添加Mg2+有利于大多數微生物產脂肪酶，而大量的Na+對產酶有抑制作用，因此，選用0.1% MgSO4·7H20 和0.25% NaCl 復合物為無機鹽。
　　故確定以可溶性淀粉為碳源，酵母膏和NH4NO3 為復合氮源，0.1%的MgSO4·7H20 和0.25%的NaCl 為無機鹽進行下一步的優化。
　　
　　2.4 部分因子實驗篩選液體發酵的顯著因素應用部分因子實驗對培養基的組成進行篩選，試驗設計及實驗結果見1。為了統一實驗結果，以對初始培養基的相對酶活作為響應值。各因素水平編碼值及回歸分析見。
　　R2=99.62%結果顯示，培養基成分中對SWWL6 產酶影響較顯著是酵母膏、NH4NO3（置信度≥99%）。
　　且兩者對產酶均呈現正效應。該方程的決定系數R 為99.62%明回歸方程擬合良好。由顯著因子效應可以看出，在原始培養基基礎上逐漸增加酵母膏、NH4NO3 的濃度對產酶有有利。
　　其他因素對產酶影響不顯著，維持在低水平。所以選擇酵母膏、NH4NO3 這兩個因素作為下一步研究對象。
　　
　　2.5 最陡爬坡實驗針對酵母膏、NH4NO3 質量濃度進行最陡爬坡實驗。實驗設計及實驗結果如所示。由結果可知，最大產酶區在第4 次試驗附近，故以實驗4 的條件為響應面實驗因素水平的中心點。
　　
　　2.6 中心組合設計應用 MINITAB 軟件設計中心組合實驗，采用22 全因子中心組合實驗，共13 次試驗。中心組合實驗因素水平見4, 2 因素5 水平的響應面中心組合實驗設計及實驗結果如5所示。
　　2.6.1 響應面回歸模型的建立及置信度分析由 MINITAB 軟件擬合得到多項式回歸模型為：Y=344.7-24.4X1 -16.5X2-55.5X1*X1-14.2X1*X2-43.1X2*X2 回歸方程系數顯著性分析如6 所示,模型方差分析見。
　　R2=98.5%由可知回歸方程的一次項、平方項的系數和均方差較大，交互項的系數和均方差較小，說明兩個因素間交互效應較小。結果明，在α=0. 0001 水平上，該模型失擬不顯著，回歸高度顯著。決定系數R2 為98.5%，說明模型能解釋98.5%脂肪酶產量的變化,回歸擬合程度較好。該方法為SWWL6 發酵產耐有機溶劑脂肪酶提供了一個合適的模型，因此可用上述模型代替真實試驗點對脂肪酶發酵進行分析和預測。
　　2.6.2 響應因子水平的優化圖 4 繪制了中心組合響應面，以酵母膏和硝酸銨的水平作為平面坐標，以脂肪酶相對酶活作為響應值。
　　從響應面的立體圖可知，回歸模型存在最大值，最大值的穩定點是在（-0.2028，-0.1585），對應的X1、X2 實際取值為（0.640，0.384），Y 的最大估計值為348.44。即當酵母膏和NH4NO3的濃度為0.640%和0.384%時，模型預測的最大相對酶活為348.44%此條件下進行重復搖瓶發酵試驗，獲得實際平均產酶活力為347.98%。預測值與實際值之間的良好擬合性證實該模型的有效性。
　　
　　3 結論
　　
　　本文應用部分因子設計和響應面法對Bacillus cereus SWWL6 發酵產酶營養條件進行快速、有效優化。優化后培養基的組成為：淀粉1%，酵母膏0.64%，NH4NO30.384%，MgSO4·7H200.1%，NaCl 0.25%。在優化條件下搖瓶發酵48h 產脂肪酶是優化前的3.48 倍。

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