論急性運動對骨骼肌mTOR信號通路的影響

論急性運動對骨骼肌mTOR信號通路的影響

摘　要:目的:研究急性運動或AICAR注射對mTOR及下游信號的影響,旨在探討AMPK調控骨骼肌蛋白合成的機制。方法:52只雄性SD大鼠分為4組:安靜對照組(n=8)、運動組(n=18)、生理鹽水注射對照組(n=)、AICAR注射組(n=18)。運動速度26 m/min,坡度10%,時間60 min。運動和注射組分別在結束后即刻、1h、6 h和1 h、2 h、6 h取材。結果:運動后即刻、注射后1 h,mTOR Ser2448磷酸化(分別下降45%和38%)和4E-BP1 Thr37/46磷酸化均顯著降低(分別下降34%和38%),運動后1 h和注射后2 h mTOR及4E-BP1開始增加,6 h達峰值。注射組S6K1 Thr389磷酸化水平在各時間點無顯著變化,運動組均顯著升高(分別增加42%、52%和57%)。結論:一體育論文網次性劇烈運動或AICAR注射導致蛋白合成的暫時抑制,其機制與AMPK下調mTORSer2 448及其下游信號4E-BP1 Thr37/46的磷酸化水平有關,但未發現S6K1 Thr389磷酸化水平的下調。

關鍵詞:AMPK;mTOR;蛋白合成;骨骼肌

　　近年來,一些研究證實5′-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(5′- AMP activated protein kinase , AMPK)能抑制蛋白合成[1-2],其分子機制可能涉及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路[3]。AMPK通過何種機制調控mTOR信號通路目前還未闡明,初步的研究涉及mTOR信號通路上的多個分子如PKB、TSC2、mTOR、4E-BP1、S6K1等,但其作用的主要靶點還不清楚。急性運動或AICAR注射時,AMPK活性和mTOR信號通路的變化時程有什么特點?二者有什么樣的關系?目前未見報道。本實驗采用一次性運動、一次性AICAR注射方法,研究運動或AICAR對骨骼肌mTOR信號通路的影響,探討AMPK抑制骨骼肌蛋白合成的分子機制。實驗假設AMPK對蛋白合成的抑制涉及mTOR信號通路。

1　材料與方法

1.1　動物及分組

  　實驗動物:8周齡健康雄性SD大鼠,體重180~200 g,由北京大學醫學部實驗動物中心提供。晝夜節律人工控制光照(光照時間為07:00-19:00),環境溫度(23±2)℃,動物自由取食及飲水。分組:52只雄性SD大鼠分為安靜對照組(n=8)、運動組(n=18)、生理鹽水注射對照組(n=8)、AICAR注射組(n=18)。表1　一次性AICAR注射或運動分組及體重g組別即刻取材1 h取材2 h取材6 h取材安靜組240±10(n=8)運動組256±6(n=6) 252±11(n=6)—256±7(n=6)生理鹽水注射組189±6(n=8)AICAR注射組—191±5 (n=6) 186±6(n=6) 188±7(n=6)投稿日期:2008-04-22基金項目:國家自然科學基金項目,批準號:30671013。通信作者:曾凡星。作者簡介:張國華,副教授,博士,研究方向運動生理學�！　∽⑸浜瓦\動方案:注射組以0·5 mg/g體重劑量在大鼠后肢大腿外側皮下一次性注射AICAR溶液(濃度為65 mg/mL),生理鹽水注射部位、劑量同AICAR。運動組以26 m/min的速度,10%的坡度進行一次性運動,時間為60 min。

1·2　取材方法

 　 運動組分別在運動后即刻、1 h、6 h取材,AICAR注射組分別在注射后1 h、2 h、6 h取材。取材前動物用20%的烏拉坦腹腔麻醉(0·8 mL/100 g體重)后,速取右后肢腓腸肌的白肌部分(位于腓腸肌外側淺層)約200 mg,裝入凍存管后投入液氮中保存,用于AMPK活性及mTOR、4E-BP1和S6K1磷酸化測定。

1·3　測試方法

  　AMPK活性的測定采用放射性同位素方法,即根據AMPK使特異性肽底物SAMS(氨基酸序列為HMR-SAMSGLHLVKRR)磷酸化的原理,以[γ-32P]ATP作為磷供體檢測酶的活性。按照ShinTerada[4]和Wim[5]提供的方法進行,AMPK活力單位: 30℃條件下,每分鐘將1 nmol磷催化轉入SAMS的酶量即1個單位酶活。mTOR、4E-BP1、P70S6K1磷酸化測定采用western blot方法。

1·4　統計處理

  　全部統計學分析均采用SPSS13·0統計軟件進行分析。計量資料用均數±標準差(X±SD)表示,計量資料的比較用單因素方差分析。顯著性水平取P<0·05,非常顯著性水平取P<0·01。

2　結　果

2·1　急性運動或AICAR注射AMPK活性的變化

  　和安靜對照組相比,一次大強度運動后即刻,腓腸肌AMPK活性升高180%(P<0·01),2 h組和1 h相比顯著下降,但仍高于對照組(P<0·01),6 h恢復到對照組水平。和生理鹽水注射對照組相比,一次AICAR注射后1 h,腓腸肌AMPK活性升高62%(P<0·01),2 h時基本恢復(與對照組相比無顯著差異,P>0·05),6 h時完全恢復。表2　急性運動或AICAR注射腓腸肌AMPK活性的變化對照組(Control, n=8)即刻取材組(n=6)1 h取材組(n=6)2 h取材組(n=6)6 h取材組(n=6)急性運動3·18±0·29 8·60±0·75**5·41±0·63**$$- 3·12±0·34AICAR注射3·11±0·33 - 5·03±0·57**3·63±0·46 3·29±0·36
　　注:結果為平均數±標準差(X±SD)。**表示與對照組相比有非常顯著性差異,P<0·01。$$表示與即刻相比,有非常顯著性差異,P<0·01。

2·2　急性運動或AICAR注射mTOR、4E-BP1、P70S6K1磷酸化水平的變化　和安靜對照組相比,一次大強度運動后各目標蛋白檢測位點的磷酸化相對含量(和actin比較的相對灰度值)變化如下:mTOR Ser2448在運動后即刻下降45%(P<005),2 h開始升高,6 h時進一步升高(增加87%,P<0·05);4E-BP1 Thr37/46在運動后即刻下降34%(P<0·05),2 h時增加1·4倍(P<0·01),6 h時進一步升高(增加2·4倍,P<0·01);S6K1Thr389在各時間點分別增加42%、52%和57%(P<0·05)。

　　注:結果為平均數±標準差(X±SD)。*表示與安靜對照組相比有顯著性差異,P<0·05;**表示有非常顯著性差異,P<0·01。和一次生理鹽水對照組相比,一次AICAR注射后各目標蛋白檢測位點磷酸化相對含量(和actin比較的相對灰度值)變化如下:mTOR Ser2448在注射后1 h下降38%(P<0·05),2h開始升高,但無顯著性差異,6 h時進一步升高(增加97%,P<0·05);4E-BP1 Thr37/46在注射后1 h下降38%(P<0·05),2 h時升高61%(P<0·05),6 h時進一步升高(增加188%,P<0·01);S6K1Thr389在各時間點均無顯著變化(P>0·05)。

3　分析與討論

3·1　急性運動或AICAR注射激活骨骼肌AMPK信號

  　5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5′-aminoimidazole-4-carboxam-ide ribonucleoside, AICAR)是目前應用較多的AMPK激活劑,它是腺苷的類似物,進入細胞后在腺苷激酶的作用下轉化為單磷酸核苷(ZMP),ZMP是AMP的類似物,它能夠變構激活AMPK和其上游激酶AMPKK,后者繼而激活AMPK,此過程并不引起細胞AMP、ADP和ATP水平改變[6]。本實驗結果表明,以0·5 mg/g劑量一次性皮下注射AICAR能顯著激活骨骼肌AMPK,注射后1 h AMPK活性增加61%(P<0·01),2 h時仍略高于安靜水平17%(P>0·05),但無顯著性差異,6 h恢復正常。一次性大強度運動后即刻AMPK活性較安靜時增加1·8倍,此后持續下降,但1h時仍高于安靜水平,6h時已完全恢復正常。雖然無法比較運動和AICAR激活AMPK的效應,畢竟運動強度和時間與藥物濃度之間尚無法進行對應,但本實驗結果表明運動和注射AICAR均能有效激活骨骼肌AMPK,且恢復時程基本一致。不過,從本實驗結果來看,二者仍表現出一些差異。其一,大強度一次性運動明顯強于AICAR以0·5mg/g的劑量注射對AMPK的激活程度(數據顯示如此)。事實上,運動和AICAR激活AMPK的機制是不相同的,前者主要通過AMP和ATP的作,后者則通過ZMP的作用。ZMP雖然是AMP的類似物,但其激活AMPK的方式可能與AMP不同。有人認為ZMP可能作用AMPK的外部機制如激活糖原磷酸酶等其他AMP敏感酶,或是經腺苷受體和/或腺苷轉運體發揮作用[7-8]。ZMP是否也象AMP一樣,通過增加上游激酶對AMPKαThr172位點磷酸化而激活AMPK也不清楚,而且,AICAR增加ZMP的同時, ZTP亦見增長,并通過變構效應妨礙AMPK的完全激活。所以,ZMP的作用遜于AMP,這可能是AICAR的作用不如運動強烈的部分原因。其二,AICAR注射大鼠注射后2 h AMPK已恢復正常,而運動大鼠在運動后2 h仍高于安靜水平。所以,AICAR對運動的效應模擬也不是完全一致的。

3·2　一次AICAR注射或運動對mTOR信號通路的影響

　   不同運動形式對骨骼肌蛋白代謝的影響非常復雜。高頻電擊、抗阻運動能促進蛋白合成,造成凈體重增加,劇烈或長時間耐力運動對蛋白代謝可能具有抑制作用。Bolster等發現,使用AICAR孵育使大鼠肝細胞蛋白合成速率明顯下降[1]。使用AICAR誘導C2C12肌管AMPK激活發生于注射后第15 min,并在隨后持續上升,相應地,在第15、30和60 min蛋白合成速率分別下降為注射前的90%、70%和63%[9]。實驗表明,AMPK抑制肌細胞蛋白合成的機制涉及對mTOR信號通路的下調。本實驗發現,一次AICAR注射后1 h,mTOR Ser2448、4E-BP1 Thr37/46磷酸化水平均下降38%,2 h時開始升高(分別
增加26%、61%),6 h時達峰值(分別增加97%和188%),但S6K1 Thr389磷酸化水平在各時間點無顯著變化,表明一次注射AICAR能顯著抑制骨骼肌mTOR信號通路,其作用靶點涉及mTOR Ser2448和4E-BP1 Thr37/46磷酸化水平的抑制,但不涉及S6K1 Thr389磷酸化水平的抑制。結合AICAR注射后AMPK活性的變化規律分析,當AMPK活性最高時,mTOR及其下游信號磷酸化水平最低,隨著AMPK活性的逐漸下降,mTOR信號通路磷酸化水平逐漸上升。因此,ATCAR注射對mTOR信號通路的抑制應該是AMPK依賴性的本實驗還發現,一次性大強度運動后即刻,mTOR Ser2448和4E-BP1 Thr37/46磷酸化水平分別下降45%和34%,2 h時開始升高(分別升高13%和1·4倍),6 h時達峰值(分別升高87%和2·4倍);S6K1 Thr389磷酸化水平在運動后即刻即見上升,并持續至運動后6 h(分別增加42%、52%和56%,P<0·05),表明一次性大強度運動能顯著抑制mTOR及下游4E-BP1信號,但不能抑制S6K1,運動后恢復期蛋白合成增加。結合AMPK活性的變化情況看,運動后即刻,AMPK活性最大,此時mTOR磷酸化水平最低,而運動后6 h,隨著AMPK活性的恢復,mTOR磷酸化水平達到峰值,表明運動后mTOR及下游信號分子的激活與AMPK有關。但運動后1 h,mTOR、4E-BP1和S6K1信號磷酸化開始增加,而此時AMPK活性仍顯著高于安靜水平,這似乎令人費解。本課題組對此的理解是,AMPK并非控制mTOR信號通路的唯一機制,運動時可能還有其他機制同時被激活,如MEK/ERK/P90RSK信號通路,該通路和AMPK的作用相反,能促進蛋白合成,運動中AMPK的作用占優勢。運動后一定時間盡管AMPK仍維持激活狀態,但隨著其活性的下降,其他激活mTOR通路的機制可能開始占據優勢,從而無視AMPK對mTOR通路的抑制效應。所以,運動后mTOR信號通路的激活可能部分與非AMPK依賴性機制的作用有關。AMPK作用于mTOR信號通路的靶點存在爭議。首先,AMPK是否能使mTOR去磷酸化而降低其活性?一些研究認為,AMPK能直接或經mTOR的分子伴侶raptor間接作用于mTOR而抑制其活性。1)直接磷酸化mTOR Thr2446位點,這使得另一位點Ser2448的磷酸化被抑制,而Ser2448位點是PKB信號的作用靶,其磷酸化是激活mTOR的最主要方式,所以,AMPK磷酸化mTOR Thr2446位點后,通過抑制PKB介導的Ser2448位點的磷酸化而間接抑制mTOR的活性[10];2)通過影響mTOR的分子伴侶raptor而調節其活性。從本研果來看,無論是AICAR注射還是跑臺運動都導致了mTOR在Ser2448位點的去磷酸化,似能同意AMPK直接或通過PKB間接抑制mTOR的觀點。其次,AMPK是否能去磷酸化4E-BP1S6K1?目前存在三種不同的看法:1) AMPK對S6K1和4E-BP1的磷酸化水平均有作用。有研究發現,使用AICAR誘導AMPK激活后能使raptor-mTOR絡合物變成關閉的、活性下降的形式,導致其磷酸化下游靶4E-BP1和S6K1的能力下降,從而抑制mTOR信號通路[9];2) 4E-BP1是AMPK的主要作用靶。Hans等的研究發現,人體一次性抗阻運動后即刻AMPK活性升高并持續至1 h,蛋白合成速度明顯下降,運動后1~2 h開始升高。同時,運動后即刻4E-BP1磷酸化下降,1~2 h開始升高,而TSC2、PKB、mTOR、eEF2均無顯著變化,因此認為AMPK主要通過對4E-BP1的去磷酸化而抑制蛋白合成[2]。David等的研究亦得到類似結果[11];3) S6K1是AMPK的主要作用靶。Gustavo等發現,一次高頻電擊使大鼠脛骨前肌S6K1磷酸化水平在刺激后3 h顯著增加并持續至6 h,并且AICAR能以劑量和時間依賴方式抑制HCE-T細胞S6K1活性[12]。本實驗結果支持4E-BP1是AMPK的主要作用靶點的觀點,因為無論是AICAR注射還是跑臺運動均未發生骨骼肌S6K1的去磷酸化。另外,AMPK是否能控制mTOR的上游信號?雖然本研究未涉及上游指標,但從文獻報道可以得出一些認識。有研究表明,AMPK在兩個位點(Thr1227和Ser1345)直接磷酸化并激活TSC2,通過使這兩個位點突變證明磷酸化事件增加了TSC復合體抑制mTOR通路的能力[13]。人們認為TSC2抑制mTOR的活性的分子機制可能涉及小GTP酶Rheb。不過,部分研究不支持AMPK對TSC2的調節作用[2,11]。AMPK是否能影響mTOR的另兩種上游信號PI3K和PKB亦存在爭議。有研究發現在C2C12肌管中使用AICAR導致IRS-1在Ser789位點磷酸化增加,而該位點的磷酸化導致與IRS-1相關的PI3K活性下降[14]。另一在體研究發現AICAR使骨骼肌PKB在Ser473位點磷酸化水平下降[15],然而,在培養的HCE-T細胞中,使用AICAR未見到這種影響[16], Cheng等發現AICAR不能通過PKB介導mTOR信號通路功能[17]。本研究結果表明,AICAR和運動無論是對AMPK的激活,還是對蛋白合成的抑制,都表現出較好的相似性。大量的運動(包括抗阻、電擊和跑臺運動的人體和動物模型)研究表明,抗阻或劇烈耐力運動中,蛋白合成被抑制,運動后恢復期這種抑制被解除,隨后進入恢復性增加階段,恢復過程可能持續到運動后24~48 h[11]。所以,運動對骨骼肌蛋白合成的影響是運動中的抑制和運動后恢復性增加兩過程的中和。本實驗對AICAR注射效果的研究表明,mTOR及下游信號4E-BP1被短暫抑制,隨后磷酸化水平增加,這和運動組的觀察結果是一致的。不過,AICAR注射未能影響S6K1的磷酸化水平,而運動后即刻、1 h和6 h均見S6K1磷酸化水平增加,尚不能解釋造成這種不一致的原因,但至少再次表明AICAR并不能完全模擬運動效應�？偟膩砜�,目前對AMPK與mTOR信號通路關系的研究主要集中在mTOR及下游信號上,多數學者同意AMPK能通過磷酸化事件調節mTOR和4E-BP1分子活性,當然,這種影響可能是直接也可能是間接的。S6K1也可能是AMPK的另一作用靶,但本研究和部分報道未支持這一觀點。AMPK與mTOR信號通路上游分子PI3K、PKB、TSC1/2等的關系的研究材料目前還不豐富,且結論也不一致,這是本研究領域的今后需要加強的方向。由于AMPK的激活及對mTOR信號通路的作用在不同肌纖維類型(如快慢肌)、不同運動方式(如力量與耐力)、不同研究對象(如人和嚙齒動物)及不同研究方法(如等:急性運動或AICAR注射對骨骼肌mTOR信號通路的影響在體和離體)中并不相同,這可能是導致一些研究結論不一致的部分原因。

4　結　論

1)一次性劇烈運動或AICAR注射均能激活骨骼肌AMPK,并導致蛋白合成的暫時抑制,其機制與AMPK下調mTOR Ser2448及其下游信號4E-BP1 Thr37/46的磷酸化水平有關,但未發現S6K1 Thr389磷酸化水平的下調;

2)一次性劇烈運動后1h或AICAR注射后2 h,骨骼肌蛋白合成加速,6 h時達峰值,其機制與mTOR Ser2448、4E-BP1Thr37/46和S6K1 Thr389磷酸化水平升高相關,但AICAR和運動對S6K1 Thr389磷酸化水平的影響存在差異。

3)一次性劇烈運動或AICAR注射后1~6 h,AMPK信號的下調與mTOR信號通路的上調時程基本一致,但不完全同步,表明運動后蛋白合成的恢復與AMPK信號的下調有關,但也可能部分涉及其他激活mTOR的機制。

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