固定化酶領(lǐng)域不同納米復(fù)合材料的應(yīng)用性能綜述論文
摘要： 載體材料的選擇對固定化酶的性能有著至關(guān)重要的影響。 納米復(fù)合材料不僅具有納米尺寸的特性，而且可以克服單一材料的不足，在固定化酶領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。 本文就目前在固定化酶領(lǐng)域使用的納米復(fù)合載體分類進(jìn)行了系統(tǒng)的闡述，重點(diǎn)介紹了目前在固定化酶研究領(lǐng)域運(yùn)用較為廣泛的硅基納米復(fù)合材料、 碳基納米復(fù)合材料和納米纖維復(fù)合材料等材料的制備方法及不同材料對酶學(xué)性能的影響，并對這些納米復(fù)合材料固定化酶發(fā)展前景進(jìn)行了展望。
關(guān)鍵詞： 納米復(fù)合材料； 固定化酶； 硅基材料； 碳基材料。
Abstract: The choice of carrier material has a crucial influence on the performance of the immobilized enzyme.
Nanocomposites, which not only have the properties of nanoscale, but also overcome the shortcoming of a singlematerial, have attracted tremendous attention in the field of immobilized enzyme. In this paper, classifications ofnanocomposite carriers which are currently used in the field of immobilized enzyme are systematically elaborated;the preparation and the significantly enhanced enzymology properties of enzymes immobilized on Si-basednanocomposites, C-based nanocomposites and nanofibers composites are introduced. The outlook of enzymesimmobilized on these nanocomposites is also prospected.
Keywords: nanocomposites; immobilized enzyme; Si-based nanomaterials; C-based nanomaterials.
0引 言。
酶是一種可以高效控制特定化學(xué)反應(yīng)的一種通用的生物催化劑，在實(shí)際應(yīng)用中通常將酶作固定化處理。 固定化酶由于其高穩(wěn)定性、可重用性、易分離等性質(zhì)被廣泛地應(yīng)用于化學(xué)、生物、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域[1-3]. 酶固定化方法主要包括物理吸附法、共價(jià)結(jié)合法、包埋法和交聯(lián)法。 制備固定化酶過程中所采用的固定化技術(shù)、載體、介質(zhì)條件和所催化反應(yīng)類別會(huì)在一定程度上導(dǎo)致酶失活、變性，從而使酶的催化性能或保留活性降低，其中載體所帶來的分配效應(yīng)、空間障礙效應(yīng)和擴(kuò)散限制效應(yīng)是影響固定化酶催化效率的主要因素，因此探尋可行、有效的固定化載體來增強(qiáng)固定化酶的催化性能一直是固定化酶研究的熱點(diǎn)[4-6].
納米尺度的材料由于具有特殊的表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、 量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等，在聲、光、電、磁、熱性能方面呈現(xiàn)出了新的特性，在全球范圍內(nèi)引起了科學(xué)和產(chǎn)業(yè)界的極大關(guān)注[7]. 與傳統(tǒng)大尺寸材料相比， 納米材料還具有大比表面積、表面易于修飾、與酶分子尺寸相近等優(yōu)點(diǎn)，作為一種新型的酶固定化載體在生物技術(shù)領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注[8]. 納米復(fù)合材料是由不同性能的納米材料復(fù)合而成，可以有效解決單一納米材料固定化酶所面臨的問題，在保持酶活和增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性等方面有較為突出的表現(xiàn)[9]. 本文對近幾年在固定化酶領(lǐng)域所采用的納米復(fù)合材料進(jìn)行了一個(gè)系統(tǒng)的分類，并闡述了納米復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)和制備過程及其各組分對固定化酶性能產(chǎn)生的影響。
1硅基納米復(fù)合材料固定化酶研究。
由于高比表面積、高化學(xué)純度、高穩(wěn)定性、化學(xué)惰性、 無毒和易于修飾等優(yōu)良特性， 以二氧化硅（SiO2） 為代表的納米硅基材料已經(jīng)成為廣泛使用的酶固定化材料[10].
1.1磁性硅基納米復(fù)合材料固定化酶。
在空氣或酸性環(huán)境下，磁性納米粒子（MNPs）的氧化或溶解會(huì)大大限制其使用性能， 且由于 MNP之間存在的磁引力易于聚集而影響分散性能，將MNPs 導(dǎo)入硅基納米材料和將硅基納米材料覆蓋在MNPs 表面形成核殼結(jié)構(gòu)是當(dāng)前廣泛使用的保護(hù)方法。 其中核殼結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料具有核殼結(jié)構(gòu)的結(jié)合功能和獨(dú)特的磁性響應(yīng)率、低毒性和可化學(xué)修飾的表面， 在固定化酶領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力，引起了廣泛關(guān)注[11].
介孔二氧化硅（mSiO2）作為已知發(fā)展最為成熟、研究最為透徹的介孔材料具有獨(dú)特的孔道結(jié)構(gòu)（2~50 nm），不僅有利于大尺寸分子和基團(tuán)的進(jìn)入，還因其具有大量納米級(jí)孔道而具有納米材料的特性。 同時(shí)，mSiO2材料如 MCM-41、MCM-48、SBA-15 和介孔泡沫（MCFs）可以增加酶固定化材料的比表面積、提高酶的穩(wěn)定性和活性，越來越多的研究者將它作為復(fù)合材料的基體來制作酶固定化載體[12-13].
Xie 等[14]首先通過化學(xué)共沉淀法獲得磁性納米粒子 Fe3O4,再通過 stober 法在其表面形成介孔材料MCM-41, 從而獲得 Fe3O4@MCM-41 核殼結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料（圖 1）， 然后引入氨基官能團(tuán)并以戊二醛（GA）為交聯(lián)劑共價(jià)固定褶皺假絲酵母脂肪酶（CRL）。通過透射電子顯微鏡（TEM）圖像分析表明， 具有MCM-41 外殼的復(fù)合載體有效地克服了 Fe3O4粒子之間強(qiáng)磁偶極-偶極相互作用。 該法的固定化效率為 76%, 在油脂的 Sn-2 位酯交換反應(yīng)中保持優(yōu)良的催化活性和選擇性， 催化效率達(dá)到 228.2 U·g-1;重復(fù)使用性有所提高，經(jīng)過 5 次重復(fù)使用酶活基本保持不變，飽和磁化強(qiáng)度值為 26.3 emu·g-1,可以通過外加磁場達(dá)到簡易分離。 類似的，Zhu 等[15]以羧基功能化 SiO2包裹的磁性納米粒子（Fe3O4@SiO2-NH2-COOH）為載體共價(jià)固定豬胰脂肪酶（PPL），用于脂肪酶抑制劑的篩選。 熱重量分析法（TGA）和傅里葉變換紅外光譜（FTIR）表征表明，載體成功羧基功能化且通過酰胺鍵共價(jià)固定 PPL 在其表面；振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（VSM）所得磁滯回線分析表明， 載體 Fe3O4@SiO2-NH2-COOH 和 固定化 PPL 擁有高飽和磁感應(yīng)強(qiáng)度，分別達(dá)到 45.75 和 42.25 emu·g-1,相比未羧基化的 Fe3O4@SiO2（51.51 emu·g-1），磁感應(yīng)強(qiáng)度略有下降。 固定化 PPL 與游離酶相比，酶活性、可重用性、熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性都得到明顯提升，其動(dòng)力學(xué)參數(shù) Km值 從 游 離 酶 的 0.29 mmol·L-1變 為 0.02mmol·L-1,Vmax也從 3.16 U·mg-1·min-1提高到 6.40U·mg-1·min-1, 說明固定化后酶與底物的親和力和催化效率均得到提升。
Kalantari[16]在磁鐵礦團(tuán)簇表面運(yùn)用溶膠-凝膠法形成無孔 SiO2涂層得到載體 Fe3O4@SiO2（S1），并利用表面活性劑模板法在 Fe3O4@SiO2表面再分別形成介孔（S2）和大孔（S3）2 種不同硅基結(jié)構(gòu)的 SiO2涂層，從而得到無孔、介孔、大孔 3 種 SiO2涂層磁鐵礦團(tuán)簇納米復(fù)合粒子（圖 2）。將 3 種粒子氨基官能化后， 以 GA 為交聯(lián)劑通過共價(jià)結(jié)合的方式固定化洋蔥假單胞菌脂肪酶（BCL），在外加磁場的情況下都顯示出了高穩(wěn)定性和易于回收的特點(diǎn)。 結(jié)果表明，硅基涂層結(jié)構(gòu)對于固定化酶的穩(wěn)定性和催化性能方面有著顯著的影響，固定在孔徑為 1~15 nm 的介孔硅基材料的酶分子比固定在無孔硅基和大孔硅基結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性和更好的催化性能，而且S2 固 定化 BCL 效 率（62%）明 顯高于 S1（49%）和 S3（58% ）。 Wu 等[17]采用類似的方法得到復(fù)合材料Fe3O4@mSiO2共價(jià)固定酪氨酸酶， 并以無孔 SiO2所形成的磁性微球 Fe3O4@SiO2做對照組。 結(jié)果顯示Fe3O4@mSiO2具有更高的穩(wěn)定性和重復(fù)使用率，這與 Kalantari 課題組的研究結(jié)果一致。
盧冠忠課題組首先通過 γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）與 MCFs 的表面羥基反應(yīng)得到環(huán)氧官能化介孔泡沫（EMCFs），再以 L-半胱氨酸氨基官能化 Fe3O4納米粒子表面，將 Fe3O4表面氨基與 EMCFs 外側(cè)環(huán)氧基團(tuán)結(jié)合得到順磁性環(huán)氧官能化介孔泡沫（PEMCFs）[18],青霉素�；福≒GA）分子通過表面氨基與 PEMCFs 內(nèi)側(cè)表面環(huán)氧基反應(yīng)實(shí)現(xiàn)共價(jià)固定（圖 3）。 固定化 PGA 具有 8 800 U·g-1的初始活性，且在 10 次循環(huán)后保留 94.5%,相比無環(huán)氧基的 PMCFs 固定化 PGA 穩(wěn)定性提高了 13.6%,相比 MCFs 固定化 PGA 穩(wěn)定性提高了 23.3%. 在之后的固定化酶研究中，該課題組[19]在中性溶液中以三嵌 段 共 聚 物 PluronicP123 為 模 板， 正 硅 酸 乙 酯（TEOS）和三甲氧基硅基丙醛（TMSP）縮聚合成醛基功能化納米復(fù)合材料載體 Fe3O4@mSiO2. PGA 通過其表面賴氨酸殘基的自由氨基與支持材料表面醛基發(fā)生希夫堿反應(yīng)實(shí)現(xiàn)共價(jià)固定在該順磁性納米復(fù)合材料（圖 4）；并對制備中 TMSP 作為硅源的最佳含量進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，TMSP 在所有硅基組分所占物質(zhì)的量之比為 0.15 時(shí)固定化酶性能達(dá)到最佳，固定化 PGA 的酶活達(dá)到 6 231 U·g-1, 雖然與之前研究的 MCFs 類載體固定化酶方法相比， 酶活有所下降， 但該法采用一步合成法簡易了載體合成步驟，在工業(yè)應(yīng)用中有更廣闊的前景；而且固定化酶操作穩(wěn)定性良好，在 10 次循環(huán)后仍保留 91.0%的初始活力，其飽和磁化強(qiáng)度值可達(dá) 35.1 emu·g-1.
1.2有機(jī)聚合物-硅基納米復(fù)合材料固定化酶。
功能性聚合物如縮多酸、聚酰胺、聚多元醇、聚酰亞胺和聚醛由于其通用性被廣泛應(yīng)用于新材料的制備，尤其是含有醛基的有機(jī)聚合物在酶固定化方面效果顯著[20].
聚乙烯醇（PVA）是一種具有良好生物相容性、生物降解性的水溶性多羥基化合物，PVA 復(fù)合材料具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[21]. PVA 可以大幅調(diào)節(jié) SiO2溶膠-凝膠的內(nèi)部微環(huán)境用于穩(wěn)定其包埋的酶[22]. Payentko 等[23]通過使用溶膠-凝膠法制備 SiO2和氣相 SiO2（A300），將其作為納米復(fù)合材料中 2 種不同結(jié)構(gòu)特征的硅基組成部分，與由 PVA 和聚丙烯酸 （PAA）組成的聚合物相結(jié)合，分別固定化膽堿酯酶（CHE）和乙酰膽堿酯酶（ACHE），催化氯化乙酰膽堿水解反應(yīng)（圖 5）。 2種納米復(fù)合材料固定化酶均可提高酶催化活性，但在固定化 CHE 和 ACHE 方面，以 A300 為基質(zhì)的納米復(fù)合材料載體比溶膠-凝膠法制備的 SiO2為基質(zhì)的載體固定化酶的酶活分別要高出 19%和 5%,并通過掃描電鏡（SEM）圖像觀察，可以得出硅基組分結(jié)構(gòu)的差異在一定程度上影響了固定化酶的催化活性。 Singh 等[24]采用改良的 Stober 法合成了 PVA-SiO2納米雜化材料用于固定 α-淀粉酶，固定化酶活性最高可達(dá)到 21.823 U·mg-1, 是游離酶初始活性1.25 倍，6 次循環(huán)使用后仍能保留 88%的初始活性；固定化酶和游離酶的可溶性淀粉水解動(dòng)力學(xué)研究表明， 固定化酶對底物的親和力遠(yuǎn)高于游離酶，并且酶的保存限期也得到延長， 在 35 ℃儲(chǔ)藏 25 d 后保留活性仍高達(dá) 95.6%,比游離酶高出 61%.Shafiee等[25]先利用 Stober 法合成 MCM-41,再通過乳液聚合技術(shù)在 MCM-41 外表面形成聚丙烯醛， 從而得到MCM-41@ 聚丙烯醛核殼納米復(fù)合材料， 通過載體表面的醛基與酶的氨基可實(shí)現(xiàn)共價(jià)固定細(xì)毛嗜熱霉脂肪酶（TLL）。 X 射線衍射（XRD）、SEM、TEM 等表征結(jié)果表明，MCM-41 在 PVA 聚合物表面分散均勻且 MCM-41 的結(jié)構(gòu)特征得以保留，該納米復(fù)合材料固定化 TLL 在 pH 值耐受性、熱穩(wěn)定性、儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和重復(fù)使用性上展現(xiàn)出優(yōu)越的性能， 在 15 次循環(huán)使用后仍能保留 74%的初始活性。
天然生物材料因其具有獨(dú)特的性質(zhì)、 來源廣泛、環(huán)境友好、良好的生物相容性等一系列優(yōu)點(diǎn)在酶固定化的應(yīng)用中受到青睞。 植酸（PA）是一種天然提取材料，植酸具有很強(qiáng)的螯合能力，分子結(jié)構(gòu)中擁有 6 個(gè)帶負(fù)電的磷酸根基團(tuán)，帶正電荷的蛋白質(zhì)與帶負(fù)電荷的 PA 之間存在強(qiáng)靜電作用， 可形成不溶性復(fù)合物。 Zhao 等[26]利用 PA 與含正電荷的材料或基團(tuán)之間存在較強(qiáng)相互作用的原理，通過反相微乳法和靜電結(jié)合法合成 PA@SiO2納米復(fù)合材料，用于固定化葡萄糖氧化酶（GOx）；圓二色光譜（CD）表明固定化酶仍基本保持其天然二級(jí)結(jié)構(gòu)， 以 PA 和硅基材料構(gòu)建的復(fù)合載體具有非常完美的生物活性，可用于構(gòu)建高靈敏性的生物傳感器。 De Matteis[27]將右旋糖酐、黃原膠、海藻酸鈉和殼聚糖 4 種多糖分別與硅基載體（圖 6）相結(jié)合，得到一種新型的多聚糖@SiO2復(fù)合納米材料， 成功彌補(bǔ)了無機(jī)材料在生物相容性方面的不足， 并通過溶膠-凝膠法將氯過氧化物酶（CPO）包埋進(jìn)固定化載體多聚糖 @SiO2;通過對照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含有殼聚糖組分的載體固定化酶在各方面展現(xiàn)出了最為優(yōu)越的性能， 且在一定范圍內(nèi)，殼聚糖含量越大，改善固定化酶性能的效果越明顯。 殼聚糖含量為 0.54%時(shí)熱穩(wěn)定性和重復(fù)使用性達(dá)到最高，在高達(dá) 70 ℃環(huán)境下 2 h 后，仍可以保留超過 95%的活性， 反應(yīng)循環(huán)次數(shù)高達(dá) 18 次。Shahgaldian 等[28]設(shè)計(jì)出一種全新的復(fù)合式載體結(jié)構(gòu)用以固定化 β-半乳糖苷酶（ β-gal）：首先通過戊二醛作交聯(lián)劑以共價(jià)結(jié)合的.方式將 β-gal 固定在氨基修飾的 SiO2納米粒子的表面；之后通過有機(jī)硅烷縮聚反應(yīng)，3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）和正硅酸乙酯（TEOS）在 SiO2-（ β-gal）表面形成有機(jī)硅層，起到對酶的保護(hù)作用。 相比 SiO2-（ β-gal），在形成有機(jī)硅層后酶活保留 68%,但其機(jī)械強(qiáng)度、穩(wěn)定性、重復(fù)使用性均得到提升。 采用相同的固定化方法對磷酸酶、漆酶、乙醇脫氫酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行固定化研究， 結(jié)果表明通過將有機(jī)硅層厚度控制在適當(dāng)尺寸，將酶包裹在有機(jī)硅層內(nèi)并不會(huì)妨礙酶促反應(yīng)的進(jìn)行。
1.3其它硅基復(fù)合納米材料固定化酶。
納米黏土是一種層狀鋁硅酸鹽， 因其價(jià)格低廉、尺寸小，具有獨(dú)特的可嵌入屬性以及含有大量可作為酶吸附位點(diǎn)的硅醇基團(tuán)，在固定化酶領(lǐng)域引起了關(guān)注[29].Li[30]通過 MNPs 有序自組裝在納米粘土特定區(qū)域合成超順磁 Fe3O4@Clays 納米復(fù)合材料 ,經(jīng)過氨基功能化后以 GA 為交聯(lián)劑共價(jià)固定葡糖淀粉酶（GAS）。通過 TEM、FXRD、VSM 等表征結(jié)果顯示Fe3O4@Clays 具有高度有序結(jié)構(gòu)、大表面積和高磁敏感性等特性；該復(fù)合材料通過在納米黏土局部位點(diǎn)的修飾降低了由其雜質(zhì)帶來的負(fù)面影響；固定化酶的熱穩(wěn)定性和可重用性得到明顯提升；其高磁敏性簡化了分離過程，更重要的是該材料是一種可再生載體， 在固定酶失活后可實(shí)現(xiàn)回收再利用， 極大降低了在應(yīng)用中的成本。 Ilk 等[31]在十八胺-蒙脫石（ODA-MMT）有機(jī)黏土表面，通過左旋乳酸（LA）和聚（馬來酸酐-甲基乙烯基醚）共聚物（Poly（MA-MVE））的原位共聚作用得到有機(jī)-無機(jī)納米復(fù)合材料 Poly（MA-MVE）-PLA@ODA-MMT,用以固定化漆酶，通過載體結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)改善酶所處微環(huán)境，從而進(jìn)一步提高了漆酶催化效率和固定化性能。 結(jié)果表明，在最優(yōu)反應(yīng)條件下，固定化漆酶的催化效率是游離酶的2 倍， 固定化酶在 10 次循環(huán)使用后仍能保留超過77%的初始酶活，其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性也得以進(jìn)一步提高，可在 4 ℃下保存 30 d,保留活性是游離酶的 3.6 倍。
Zhang 等[32]通過原位水熱法成功地將 ZnO 納米線導(dǎo)入 mSiO2的孔道， 顯著增加了 mSiO2的比表面積（233 m2·g-1），且由于帶正電荷的 ZnO 納米線（等電點(diǎn)為 9.5）與帶負(fù)電荷的南極假絲酵母脂肪酶 CALB（等電點(diǎn)為 6.0）之間存在強(qiáng)靜電相互作用，這種全新的納米復(fù)合材料對 CALB 有非常強(qiáng)的吸附作用，酶負(fù)載量達(dá)到 196.8 mg·g-1, 較單獨(dú) mSiO2材料提高2~3 倍， 而且活力達(dá)到 667.2 U·g-1,mSiO2載體固定化酶的 5 倍，其催化的手性 2-辛醇反應(yīng)在最佳反應(yīng)條件下，轉(zhuǎn)化率為 49.1%,在酶催化手性拆分（R,S）-2-辛醇中對對映體（R）-2-辛醇乙酸酯的選擇性高達(dá)99%,在 15 次循環(huán)使用后，固定化脂肪酶仍可保留96.9%的相對活性和 93.8%的對映體選擇性。
銀納米粒子（AgNp）摻入載體材料中可以在保留固定化酶完整催化活性前提下提高其儲(chǔ)藏時(shí)間，Singh[33]以阿拉伯樹膠和明膠為模板采用雙模板聚合法聚合四甲氧基硅烷并在其中摻雜 AgNp, 得到一種新型納米復(fù)合材料。 用此材料固定的 α-淀粉酶可以在 40 ℃條件下貯藏 30 d 后仍保持其初始活性，而未摻雜 AgNp 的復(fù)合材料在 48 h 會(huì)失去 31%的活性， 相比固定化酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)與游離酶相比，Km值為原來的 116.4%,Vmax提高了 55.1%.
2碳基納米復(fù)合材料固定化酶研究。
碳基材料具有耐高溫、導(dǎo)熱性能良好、化學(xué)惰性、良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，碳基納米材料如石墨烯、碳納米管已在固定化酶領(lǐng)域取得了廣泛的應(yīng)用[34-36]. 制備碳基納米復(fù)合材料不僅可以保留碳基材料本身所固有的優(yōu)點(diǎn)，也可克服其韌性差、性能異變、分散性能不好、酶的固定化效率低等缺點(diǎn)。
2.1石墨烯納米復(fù)合材料固定化酶。
石墨烯是一種新型的二維蜂巢晶格結(jié)構(gòu)、單原子厚度的碳基納米材料，被認(rèn)為是目前世界上最薄的材料，其在導(dǎo)熱率、機(jī)械強(qiáng)度、化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性等方面擁有優(yōu)良的屬性，如今被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，在工業(yè)應(yīng)用上具有非常好的前景[37].氧化石墨烯（GO）是石墨烯的衍生物，非常適合吸附金屬氧化物納米顆粒以及固定大量的酶。 GO 除了大比表面積和呈現(xiàn)出非常好的生物相容性之外，其表面有環(huán)氧基、羧基、羥基等一系列官能團(tuán)，因此其在水中有很好的分散性并易于化學(xué)修飾[38].在生物領(lǐng)域，石墨烯及其衍生物作為一種與生物分子有強(qiáng)相互作用的新興納米材料已被運(yùn)用于生物傳感器的制備，如 Li 等[39-40]利用石墨烯量子點(diǎn)修飾的熱解石墨烯電極[39]及 GO 修飾金電極[40]來獲得靈敏度更高、選擇性更強(qiáng)的電化學(xué)傳感器。
2.1.1 磁性石墨烯納米復(fù)合材料固定化酶。
GO 作為固定化材料由于其強(qiáng)親水性很難從水溶液中分離，并且 GO 納米薄片之間由于存在強(qiáng) π-π 鍵相互作用容易結(jié)塊，從而導(dǎo)致大量官能團(tuán)被覆蓋[41-42].為了進(jìn)一步拓展和優(yōu)化 GO 在生物技術(shù)上的應(yīng)用， 將其與磁性納米粒子結(jié)合形成復(fù)合材料，可以有效地改善其性能。
Zhang 等[43]通過溶劑熱法制備功能化 Fe3O4磁性納米粒子， 其氨基和化學(xué)沉淀法制備的 GO 的羧酸基團(tuán)反應(yīng)，共價(jià)連接形成磁性納米復(fù)合材料 GO-CO@NH-Fe3O4（圖 7），該 材料再以 π-π 堆 積作用和氫鍵相互作用固定化胰蛋白酶（TPS），固定化酶的比重達(dá)到 0.275 mg·mg-1,其穩(wěn)定性也有所提升，可在4 ℃條件下儲(chǔ)藏 30 d 后仍可保留 84%的初始活性。GO-CO@NH-Fe3O4復(fù)合材料除了 GO 和 Fe3O4本身所帶有的特性， 還具有對微波輻射良好的吸收性能，在實(shí)際應(yīng)用中可通過微波輔助進(jìn)一步提高固定化 TPS 對蛋白質(zhì)的消化效率，分解效率是無微波輔助的傳統(tǒng)酶溶液分解法的 2 880 倍。 Jiang 等[41]利用超聲波輔助共同沉淀法成功地將溶液中的 FeSO4·7H2O 和 FeCl3·6H2O 在 GO 片 表面形成 Fe3O4納米粒子，并用于固定辣根過氧化物酶（HRP）。 固定化酶的生化性質(zhì)都得到一定的改善：貯藏穩(wěn)定性、PH 值和溫度的耐受性相比游離酶都得到加強(qiáng)；重復(fù)使用性得到了顯著增強(qiáng)， 固定化 HRP 在 4 次循環(huán)后仍保留 66%的初始活性。 Chen[42]同樣采用 Fe3O4@GO復(fù)合材料來固定化乙醇脫氫酶（ADH），除了對 pH 值耐受性和熱穩(wěn)定性得到加強(qiáng)，重復(fù)使用性也得以提高，10 次使用后，僅失去大約 20.4%的活力。 GO 制備過程中在一定程度上會(huì)破壞石墨烯表面規(guī)整度，通過化學(xué)還原法制備還原氧化石墨烯（rGO）可以在保留 GO 分散性的同時(shí)恢復(fù)其固有的優(yōu)良性能。 Shi等[44]以 GO 為氧化劑氧化 Fe2+以得到 Fe3O4納米粒子，粒子沉積在還原氧化石墨烯（rGO）表面形成納米復(fù)合材料 rGO@Fe3O4, 此材料同時(shí)結(jié)合了 Fe3O4納米粒子的磁性能和 rGO 納米片的大比表面積的特點(diǎn)，過氧化氫酶（CAT）通過氫鍵和疏水相互作用直接吸附在 rGO@Fe3O4納米復(fù)合材料表面。CAT 負(fù)載量高達(dá)（312.5±12.6） mg·g-1,固定化酶活性回收率達(dá)到 98%,除了具有很強(qiáng)的磁響應(yīng)外，在穩(wěn)定性和可重用性上表現(xiàn)出優(yōu)良的性能。
隨著酶負(fù)載量的增加，酶分子間形成空間位阻從而限制底物和產(chǎn)物之間的擴(kuò)散， 影響酶催化活性， 研究固定化過程中酶的添加量也具有重要意義。 Wu 等[45]采用水熱合成法合成 Fe3O4@rGO 納米復(fù)合材料用以固定化 HRP, 用以進(jìn)一步研究載體HRP 負(fù)載量和 HRP 初始加入量之間的數(shù)量關(guān)系 ,以及負(fù)載量增加對固定化 HRP 保留活性的影響。結(jié)果表明，HRP 負(fù)載量和 HRP 初始加入量呈線性關(guān)系，在 HRP 加入量為 25 mg·g-1時(shí)達(dá)到穩(wěn)定；HRP負(fù)載量很低時(shí)， 固定化 HRP 可以保持 90%的高活性，但其會(huì)隨著負(fù)載量的增大而降低直至達(dá)到平衡狀態(tài)。 該載體最佳 HRP 負(fù)載量為 23.3 mg·g-1,固定化效率高達(dá) 91%, 在 10 次循環(huán)使用后仍保留 70%的初始活性。Jing 等[46]將已制備好的 Fe3O4@MCM-41結(jié)合到 GO 表面，并以 3-氯丙基三乙氧基硅烷（CPS）修 飾 GO 表 面 形 成 新 型 納 米 復(fù) 合 材 料 CPS/GO-Fe3O4@MCM-41,用來共價(jià)固定 PPL（圖 8）。 Fe3O4納米粒子不僅可以通過外加磁場實(shí)現(xiàn)快速分離，更重要的是防止 GO 的集聚從而使材料表面區(qū)域和功能基團(tuán)得以保留。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該復(fù)合材料的固定化效率和最大相對活性分別達(dá)到 98%和 97.9%. 固定化酶在 30 ℃下保存 56 d 仍可保留 85%的活性，遠(yuǎn)高于游離酶的 19%,10 次循環(huán)使用后的保留活性仍高達(dá) 87%,表明該 GO 復(fù)合材料在提高穩(wěn)定性和可重用性方面具有重要作用。 值得一提的是，該法中酶和支持材料之間幾乎不存在空間位阻，這大大提高了催化效率。
2.1.2 有機(jī)聚合物-石墨烯納米復(fù)合材料固定化酶。
聚合離子液體（PILs）兼具離子液體和聚合物兩者優(yōu)點(diǎn)，如良好的電導(dǎo)性、熱穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度等，PILs 在合成各種納米材料中是非常有效的穩(wěn)定劑或改性劑。 近年來，利用聚合離子液體修飾石墨烯表面改善其在水溶劑中的可分散性和溶解性成為一種行之有效的方法[47]. Li 等[48]首先用 NaBH4預(yù)處理 GO 表面得到 rGO,再通過原位聚合法，通過合成聚 合 離 子 液 體 1-乙 烯 基-3-丁 基 咪 唑 溴 化 物（ViBuIm+Br-）形成納米復(fù)合材料 poly（ViBuIm+Br-）@GO, 通 過 靜 電 作 用 將 GOx 固 定 在 其 表 面 ,poly（ViBuIm+Br-）不僅改善了載體的疏水性，且在水溶液中可提供正電荷以進(jìn)一步在溫和條件下實(shí)現(xiàn)酶的固定化。
殼聚糖（CS）是一種天然多糖，具有多種官能團(tuán)，無毒性，擁有良好的吸附性能、生物相容性和生物降解能力， 但其機(jī)械強(qiáng)度差的缺點(diǎn)一直限制其應(yīng)用。 將 GO 和 CS 通過共價(jià)連接制備 GO@CS 復(fù)合材料可以較好地解決上述缺點(diǎn)。 Li 等[49]首先通過Hummers 法制備 GO, 再使用 EDC /NHS 為縮合劑將 CS 共價(jià)連接到 GO,FeCl3·6H2O 和 1,6-己二胺通過溶劑熱反應(yīng)在其表面生成 Fe3O4納米粒子從而得到復(fù)合材料 CS-GO@Fe3O4（圖 9），并通過載體靜電吸附（Ⅰ法）、以 GA 做交聯(lián)劑共價(jià)結(jié)合（Ⅱ法）、以亞氨基二乙酸（IDA）和 Cu2+修飾載體通過金屬螯合作用（Ⅲ法） 固定化 CAL,3 種固定化方法都提高了 CAL對 pH 值和溫度的耐受性， 最適溫度范圍從游離酶的 45~50 ℃， 拓寬到 45~65 ℃， 且在 75 ℃下仍可保留 75%的活性； Ⅱ法在重復(fù)使用性上表現(xiàn)最為優(yōu)異， 且 10 次循環(huán)使用后仍可保留 70%的保留活性。
2.2碳管納米復(fù)合材料固定化酶。
碳納米管作為一種一維納米材料具有良好的導(dǎo)電性、吸附能力強(qiáng)、生物相容性好等許多獨(dú)特屬性， 隨著對碳納米管及納米材料研究的不斷深入，碳納米管在生物技術(shù)領(lǐng)域也被廣泛使用[50-51].
Li 等[52]通過 Cu2+螯合作用將 GAS 固定在表面接有聚酰胺-胺型樹枝狀高分子（PAMAM）的磁性碳納米管上， 考察了該方法固定化 GAS 的相關(guān)性能。結(jié)果表明酶的負(fù)載量達(dá) 20.6 mg·g-1,固定化酶的活性為游離酶初始活性的 71.2%,經(jīng)過 10 次循環(huán)使用后，固定化酶仍能保持 84.2%初始活性，且載體再生后仍然保留著其原有優(yōu)良的磁分離能力、快速固定化酶能力等特性（圖 10）。 Choi[53]將多壁碳納米管（CNT） 在 全氟磺酸 （Nafion） 溶液中分散氧化形成CNT@Nafion 納米復(fù)合材料， 并通過等離子腐蝕在其表面獲得的微孔結(jié)構(gòu)共價(jià)固定 GOx 和漆酶，其固定化效率得到明顯改善。Xu 等[54]制成 1-芘丁酸改性摻氮碳納米管（PBA@NCNTs）均質(zhì)納米復(fù)合材料，用于酶的固定化和葡萄糖生物傳感的研究，GOx 在PBA/NCNTs 表面酶負(fù)載量高達(dá) 1.986 mmol·cm-2.而 Amatatongchai[55]將氨基功能化碳納米管（CNT-NH2）、金納米粒子和牛血清白蛋白組成納米復(fù)合材料用以共價(jià)固定漆酶，并考察了該酶電極上漆酶直接電化學(xué)和生物傳感性能，結(jié)果表明合成的納米復(fù)合材料有良好的酶直接電化學(xué)活性，也保持了漆酶的生物活性， 同時(shí)該生物傳感器具有良好的選擇性、重復(fù)使用性及穩(wěn)定性。
3納米纖維復(fù)合材料固定化酶研究。
3.1聚合物納米纖維復(fù)合材料固定化酶。
納米纖維復(fù)合材料固定化酶易從反應(yīng)介質(zhì)中分離并可應(yīng)用于連續(xù)操作， 因此被廣泛應(yīng)用于催化、生物醫(yī)學(xué)和制藥領(lǐng)域[56].
靜電紡絲是一種將各種聚合物、 高分子共混物、溶膠-凝膠、復(fù)合材料等制備成纖維直徑在 1~100 nm 的多功能納米纖維的技術(shù)，由于其制造工藝簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)成為世界材料科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[57]. El-Aassar[58]通過靜電紡絲技術(shù)制得聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯腈（poly AN-co-MMA）納米纖維，并以納米纖維羰基基團(tuán)共價(jià)連接的聚乙烯亞胺（PEI）為連接臂共價(jià)固定化 β-半乳糖苷酶。 研究表明，耦合 PEI 數(shù)量是影響固定化酶催化性能、保留活性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的主要因素。 檢測結(jié)果表明，固定化酶的穩(wěn)定性得到明顯的改善，最適溫度比游離酶高 5 ℃且對溫度具有更好的耐受性。
Manuel[59]通過相同的技術(shù)制得聚丙烯腈（PAN）納米纖維薄膜，并通過 2 種不同的表面化學(xué)修飾后作為固定化葡糖氧化酶的載體。 一是通過兩步法將PAN 的腈基轉(zhuǎn)化為氨基；二是先通過 NaOH 處理生成羧酸基團(tuán)，再進(jìn)一步與己二胺（HMDA）反應(yīng)生成反應(yīng)性間隔臂來固定化酶。 結(jié)果表明，化學(xué)修飾后載體表面沒有發(fā)生變化且其機(jī)械強(qiáng)度得以改善，一法和二法修飾所得載體的固定化酶在 25 次循環(huán)后分別保留 54%和 60%的初始活性，酶負(fù)載量分別為1 238 μg·mg-1和 168 μg·mg-1; 且保留活性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)方面都展現(xiàn)出更為優(yōu)良的性能。
3.2纖維素納米纖維復(fù)合材料固定化酶。
纖維素是自然界分布最廣、含量最多的一種天然高分子，具有可降解、可再生、密度小以及對生態(tài)環(huán)境不產(chǎn)生污染等優(yōu)點(diǎn)。 但是，天然纖維素不管在物理形態(tài)還是化學(xué)性能上都存在一些缺陷，例如溶解性差、不耐化學(xué)腐蝕、強(qiáng)度有限等。 納米微晶纖維素（NCC）是指在尺度上至少有一維達(dá)到 100 nm 或100 nm 以下的纖維素， 同纖維素或微晶纖維素相比，NCC 不僅具備生物相容性、更高的拉伸強(qiáng)度、更多的結(jié)晶區(qū)和更高的結(jié)晶度， 而且在納米尺度下，其表面暴露著大量羥基，使得 NCC 具有高親水性、高穩(wěn)定性與高反應(yīng)性，同時(shí)還具有高透明性與液晶性以及比表面積高的特點(diǎn)。 NCC 在酶固定化、藥物傳輸、 生物醫(yī)學(xué)等方面都得到了廣泛的應(yīng)用[60-61].NCC 與納米材料復(fù)合可以得到性能優(yōu)越的復(fù)合載體用于固定化酶， 且可以很好地提高其機(jī)械強(qiáng)度。Xu 等[62]通過在 CS/PVA 納米纖維薄膜中添加 NCC以解決原本機(jī)械強(qiáng)度差的問題。 結(jié)果顯示，加入 5%NCC 的納米復(fù)合薄膜的拉伸強(qiáng)度比未加入的高出3.7 倍；固定化 HRP 的最高酶載量達(dá)到 384 mg·g-1,CS/PVA-NCC 薄膜相比 CS/PVA 薄膜固定化酶的穩(wěn)定性和可重用性進(jìn)一步提高， 去除 3,3′，5,5′-四溴雙酚（TBBPA）效率從 14.6%·h-1提升至 32.0%·h-1,在工業(yè)處理廢水上具有潛在的應(yīng)用。 盡管 NCC 具有很多優(yōu)異性能， 但由于其在水中良好的分散性，NCC 很難從反應(yīng)體系中分離，從而限制了在工業(yè)上的應(yīng)用， 而利用 NCC 制備磁性納米復(fù)合材料是一個(gè)很好的選擇。NCC 和 Fe3O4表面都帶負(fù)電荷，因此Fe3O4很難穩(wěn)定吸附在 NCC 表面， 而 CS 是生物相容性良好的天然親水性陽離子多糖。 婁文勇[63]課題組利用 CS 和 NCC、Fe3O4之間存在的靜電相互作用， 采用共沉淀-靜電自組裝技術(shù)合成磁性纖維素納米晶體復(fù)合物 MNCCs（圖 11），用以共價(jià)固定化木瓜蛋白酶（PAP），成功解決了 NCC 材料不易回收的問題。 固定化后的 PAP 呈現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性，在40 ℃下存儲(chǔ) 7h 后仍能保持高于 80%的相對活性，而游離酶則低于 30%; 同樣 pH 值穩(wěn)定性也有所提高，適應(yīng)范圍從 5~7 提高到 5~10;儲(chǔ)藏性能十分優(yōu)越， 可在 40 ℃儲(chǔ)藏 16 d 后仍保持 93.6%的相對活性；且固定化后的催化效率顯著優(yōu)于游離酶。
后來該課題組[64]又采用共同沉淀-交聯(lián)技術(shù)，先使 Fe3O4與 NCC 靜電結(jié)合， 再以 CS 覆蓋其表面合成 MNCCs,并用于固定化 PAP 來進(jìn)行二肽丙氨酰谷氨酰胺（Ala-Gln）的高效生物合成，MNCCs 的酶負(fù)載量達(dá)到 333 mg·g-1,保留活性達(dá)到 80%. Mahmoud[65]同樣采用磁性納米微晶纖維素作為固定化 PAP 的載體（圖 12），與婁文勇課題組不同的是，Mahmoud 將Fe3O4和 Au 兩種納米粒子固定在 NCC 表面。AuNPs易于制備，具有可靠的化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性、通用性，是一種可用于修飾 Fe3O4NPs 表面從而達(dá)到保護(hù) Fe3O4目的的理想材料；NCC@Fe3O4NPs @AuNPs納米復(fù)合材料最優(yōu)酶負(fù)載量為 186 mg·g-1, 且在 4℃下儲(chǔ)藏 35 d 后可保留 95%的初始活性。
4其它納米復(fù)合材料固定化酶研究。
固定不同種類的酶或在不同的反應(yīng)體系中，對固定化酶的要求也會(huì)有相應(yīng)的變化，根據(jù)實(shí)際情況來決定復(fù)合材料種類已成為制備納米復(fù)合載體的常用方法。
四氧二鐵酸鈷（CoFe2O4）磁性納米粒子是一種有卓越的生物相容性，易于分離的材料，其具有高結(jié)合能力和優(yōu)良的磁性、 化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度。Altun[66]用水熱法合成 CoFe2O4磁性納米粒子，再以鞣酸（TA）覆蓋在其表面得到復(fù)合材料 CFO-TA,用于GOx 的固定化（圖 13）。 因蛋白質(zhì)和 TA 之間存在強(qiáng)相互作用，GOx 可以通過簡單的物理吸附達(dá)到很好的固定化效果。 與其它固定化方法相比，此法不需要各種化學(xué)反應(yīng)和復(fù)雜的過程，簡單易行、耗時(shí)短，且不會(huì)對酶結(jié)構(gòu)造成破壞。 根據(jù)雙倒數(shù)分析（LB）法可得固定化 GOx 對葡萄糖擁有低親和力，固定化酶和游離酶的 Km常數(shù)為 50.05 和 28.00 mmol·L-1,固定化酶重復(fù)使用性得以提升，在 8 次連續(xù)使用后仍可保留 60%的初始活性。
Gogoi 等[67]通過等離子體聚合和濺射技術(shù)將AgNPs 均勻地嵌入苯胺聚合薄膜中 得到 Ag/PPAni納米復(fù)合薄膜。 AgNPs 的加入可以較好地保留酶的活性， 而 PPAni 作為一種在環(huán)境中穩(wěn)定的聚合物，其表面存在大量具有可供固定化酶結(jié)合的活性位點(diǎn)的自由基， 因此 Ag/PPAni 不需要借助任何表面活性劑或 GA 等交聯(lián)劑即可與酶穩(wěn)定共價(jià)結(jié)合。PPAni 具有的生物相容性和高抗微生物活性也是選擇其做固定化載體關(guān)鍵的因素，Ag/PPAni 納米復(fù)合薄膜所固定的胰蛋白酶的水解能力遠(yuǎn)高于游離酶，在蛋白質(zhì)消化領(lǐng)域用作理想載體有非常好的應(yīng)用前景。Kim 等[68]通過逐步聚合法將 Fe3O4嵌入聚苯乙烯/聚 吩 的 核/殼 復(fù) 合 物 粒 子 中 形 成 多 功 能Fe3O4NPs-PSt/PTh 納米復(fù)合材料（圖 14），此法獲得產(chǎn)物在導(dǎo)電性能上表現(xiàn)優(yōu)異，多用于生物酶傳感器的制備。
羥磷灰石（HA）作為一種具有低成本、良好生物降解性和生物相容性等優(yōu)良性能的無機(jī)生物材料在固定化酶領(lǐng)域得以應(yīng)用。 Faramarzi 等[69]首先以Fe3O4納米粒子為內(nèi)核， 以 HA 作為表面涂層合成Fe3O4NPs@HA,再在外層通過包裹具有大量氨基官能團(tuán)的聚乙烯亞胺（PEI）加以保護(hù)，最后通過表面嫁接可以有效保護(hù)酶空間結(jié)構(gòu)的 β-環(huán)糊精（ β-CD）得到 3 層核殼結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合材料 Fe3O4NPs@HA@PEI-β-CD, 此法獲得的載體固定化脂肪酶在 pH值耐受性，熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性等方面有了明顯的提升，其在經(jīng)過 5 次循環(huán)使用后可保留 80%的初始活性。
納米 CaCO3成本低廉易于合成，具有高機(jī)械強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性，并且可以為固定化酶提供高親水微環(huán)境，但由于其表面官能團(tuán)密度非常低，因此表面吸附能力較低。Preety[70]通過細(xì)乳液法制備 CaCO3納米粒子，再將環(huán)氧氯丙烷（環(huán)氧樹脂）和丙二酚（硬化劑） 聚合在聚乙烯層表面得到具有環(huán)氧基團(tuán)的聚乙烯層， 將其與 CaCO3納米粒子結(jié)合得到 Epoxy@CaCO3納米復(fù)合載體。 由于環(huán)氧基團(tuán)和酶之間存在多種共價(jià)連接，可以成功解決上述問題，并且與納米 CaCO3的結(jié)合降低了環(huán)氧基材料對酶活造成的損失并提高酶的負(fù)載量。 Epoxy@CaCO3納米復(fù)合載體成功地固定化 CAT,其酶負(fù)載量和保留活性分別為 0.67 mg·cm-2和 92.63%,比未結(jié)合 CaCO3納米粒子的 Epoxy 載體分別提升了 24%和 35%; 且 CAT的熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性得到明顯提升， 在 75 ℃下 1 h 固定化酶保留活性是游離酶的 3 倍， 在 5 ℃磷酸鹽緩沖液中儲(chǔ)藏，固定化酶半衰期比之前延長了 5 倍； 且在重復(fù)使用 30 次后酶初始活性未有明顯損失。
Zhai 等[71]通 過 將 CS 組 裝 在 埃 洛 石 納 米 管（HNTs）表面合成出 CS-HNTs（圖 15）。 通過 N2吸附-脫附、FTIR、TEM、SEM 等表征分析， 發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)為層狀多孔結(jié)構(gòu)。 該載體在共價(jià)固定 HRP 上展現(xiàn)了優(yōu)越的性能，最大酶負(fù)載量達(dá)到 21.5 mg·g-1,遠(yuǎn)高于未復(fù)合的埃洛石固定的 3.1 mg·g-1. 經(jīng)過 35 d 的儲(chǔ)藏，固定化 HRP 沒有損失任何活力，而游離酶僅保存其 27%的初始活力。 Krishnan 等[72]利用金屬納米粒子有助于增強(qiáng)復(fù)合材料的電催化、光催化等功能的特性，通過 AgNp 與 APTES 修飾過的 HNTs 表面氨基基團(tuán)的配位作用得到 AgNp@HNT 納米復(fù)合材料， 其酶負(fù)載能力達(dá)到進(jìn)一步提升， 可達(dá)到 168mg·g-1;儲(chǔ)藏穩(wěn)定性也得以加強(qiáng)，在 30 d 后仍可保留超過 90%的初始活性； 且由于金屬離子的加入，AgNp@HNT 也展現(xiàn)出優(yōu)越的電子導(dǎo)電率、電催化活性等電化學(xué)性能，在生物傳感器方面也有較好的應(yīng)用前景。
5總結(jié)與展望。
隨著納米材料研究的不斷深入，納米復(fù)合材料在固定化酶領(lǐng)域已經(jīng)廣為研究， 并取得大量成果，尤其在硅基材料和碳基材料上研究得最為廣泛。 利用納米材料得良好生物相容性、大比表面積及易于修飾的表面等特性，可以提高酶負(fù)載量和保留最大酶活，如介孔硅和石墨烯已成為實(shí)驗(yàn)室固定化酶的常用載體。 將擁有不同特性的納米材料復(fù)合得到新的載體，可以在繼承其本身所固有優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)解決單一材料某些方面的缺點(diǎn)，如固定化效率低、分離困難、影響酶結(jié)構(gòu)等。
盡管如此，納米復(fù)合材料固定化酶仍存在一些需要進(jìn)一步研究、解決的問題：（1） 復(fù)合的納米材料在制備上與單一材料固定化酶相比， 流程較為復(fù)雜，成本較為昂貴，限制了納米復(fù)合材料固定化酶在工業(yè)上的應(yīng)用；（2） 通常納米復(fù)合材料多需要進(jìn)行表面修飾，一些較為復(fù)雜的表面修飾方法會(huì)在一定程度上降低酶的活性，利用復(fù)合材料本身對酶強(qiáng)大的吸附能力實(shí)現(xiàn)固定化方面的研究較少；（3） 復(fù)合材料種類的選擇具有一定的盲目性，大多是根據(jù)材料原本屬性進(jìn)行嘗試得到相應(yīng)復(fù)合載體，未能從酶結(jié)構(gòu)特征和實(shí)際應(yīng)用出發(fā)設(shè)計(jì)高效的固定化載體，所得載體未必是復(fù)合性能最佳的選擇；（4） 現(xiàn)階段研究的重點(diǎn)主要放在納米復(fù)合材料固定化酶的制備過程上，對于所得固定化酶的催化反應(yīng)應(yīng)用方面的研究較少，限制了納米復(fù)合材料進(jìn)一步在工業(yè)上的應(yīng)用。
發(fā)展制備簡易、更為高效、適用性廣的納米復(fù)合材料仍需要我們進(jìn)一步深入研究。 通過分子模擬和表征分析，研究載體和酶之間的結(jié)合機(jī)理和酶活性部位構(gòu)象的變化機(jī)制，從而理性設(shè)計(jì)固定化載體材料種類及結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步解決固定化載體所帶來的分配效應(yīng)、空間障礙效應(yīng)和擴(kuò)散限制效應(yīng)，深入探討酶與載體表面之間的作用機(jī)理，可以更深更廣的拓展納米復(fù)合材料固定化酶的應(yīng)用范圍，將使其在生物傳感器、生物燃料電池、污水處理、藥物研制等方面擁有光明的發(fā)展前景。
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