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新型反相限進(jìn)材料對(duì)蛋白質(zhì)的排阻特性分析論文
摘要：以溴代硅膠為引發(fā)劑，CuBr/2,2-聯(lián)吡啶為催化體系，在改性硅膠上經(jīng)二步表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（SI-ATRP）制備內(nèi)表面接枝甲基丙烯酸十八烷基酯（C18）、外表面接枝甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯（GMA）、水解得到表面含大量二醇基的新型反相限進(jìn)材料。使用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、元素分析和熱重分析（TGA）對(duì)其表征，采用靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)研究反相限進(jìn)材料的吸附性能，其對(duì)磺胺二甲氧嘧啶和土霉素的最大吸附量分別為 18. 02 和 4. 80mg / g.結(jié)合固相萃取（SPE）評(píng)價(jià)其對(duì)大分子蛋白質(zhì)的排阻性能，以牛血清白蛋白（BSA）作為排阻大分子模型，排阻能力達(dá) 90%.將其用于牛奶中土霉素的分離富集，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)，土霉素的平均加標(biāo)回收率為89. 19% ,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 3. 03% .有望將新型反相限進(jìn)材料和 HPLC 或液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）等分析系統(tǒng)結(jié)合應(yīng)用于生物樣品的處理和檢測(cè)。
關(guān)鍵詞：限進(jìn)材料；表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合；牛血清白蛋白；磺胺二甲氧嘧啶；土霉素；牛奶。
Abstract:A novel reversed phase restrict access material was prepared via two steps of sur-face-initiated atom transfer radical polymerization （SI-ATRP）。 The stearyl methacrylate （C18）and glycidylmethacrylate （GMA）were grafted on inner and outer surfaces of modified silica,allowing brominated silica and CuBr / 2,2-pyridine to serve as macro-initiator and catalyst sys-tem. After hydrolysis,we got a hydrophilic reversed phase restrict access material with rich gly-col group, which was characterized by Fourier transform infrared （FT-IR ） spectrum,elementary analysis and thermogravimetric （TGA）analysis. The static adsorption experimentwas employed for evaluating the binding capacity of the novel reversed phase restrict accessmaterial. The maximum adsorption amounts of sulfadimethoxine and oxytetracycline were18. 02 and 4. 80 mg / g,respectively. The properties of material for the exclusion of proteins likebovine serum albumin （BSA）were evaluated using solid-phase extraction （SPE）and its exclu-sion value up to 90%. The novel reversed phase restrict access material was used for the separa-tion and enrichment of oxytetracycline in milk. The high-performance liquid chromatography（HPLC）was used to detect the oxytetracycline and the average recovery was 89. 19% with therelative standard deviation （RSD）of 3. 03%. It is expected that the novel inversed restrictaccess material combined with HPLC or liquid chromatography-mass （LC-MS）analysis systemis applied to the extraction and detection of biological samples.
Key words:restrict access material;surface-initiated atom transfer radical polymerization.
表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（surface-initiated atom transfer radical polymerization,SI-ATRP）是一種強(qiáng)大且靈活的合成技術(shù)，其適用的單體范圍廣，反應(yīng)條件溫和，分子設(shè)計(jì)能力強(qiáng)，可合成預(yù)定結(jié)構(gòu)和序列的聚合物[1-3].Wang 等[4]通過(guò)反 ATRP 技術(shù)制備手性整體固定相，以 β-環(huán)糊精（β-CD）作為手性選擇劑，采用 ATRP 技術(shù)在表面接枝親水聚合物刷來(lái)提升柱的生物兼容性，將此材料結(jié)合 HPLC 檢測(cè)血漿中的手性藥物。Lv 等[5]通過(guò)逐層修飾成功制備了限進(jìn)介質(zhì)分子印跡磁性微球，用于磁性微萃取牛奶中的雙酚 A,此限進(jìn)介質(zhì)分子印跡磁性微球選擇性高，避免了生物樣品中蛋白質(zhì)在微球表面的沉積。
限進(jìn)材料是 20 世紀(jì) 80 年代[6,7]發(fā)展起來(lái)的一種用于生物樣品直接進(jìn)樣的固相萃取材料。最初，Boos 等[8-10]提出烷基-二醇基限進(jìn)材料（alkyl-diol-silica,ADS），并結(jié)合 HPLC 檢測(cè)血漿、尿液等樣品中的藥物分子。喻昕等[11]提出了一種制備 ADS 固定相的改進(jìn)方法。限進(jìn)材料提供了以下優(yōu)勢(shì)[12-14]:第一，材料的親水性外表面可以防止樣品基質(zhì)中的蛋白在表面發(fā)生不可逆吸附，延長(zhǎng)使用壽命，減少成本；第二，材料內(nèi)表面的配體可以變換不同的基團(tuán)種類，如 C4、C8、C18或離子交換官能團(tuán)等；第三，將新型材料與簡(jiǎn)便、多樣及相容性較高的 HPLC 或 LC-MS 等分析系統(tǒng)相結(jié)合[15-17],為生物樣品中藥物殘留檢測(cè)提供了一條非常有前景的發(fā)展途徑。Wang等[18]把 β-環(huán)糊精固定在硅膠內(nèi)部，構(gòu)建手性結(jié)合層，再通過(guò) SI-ATRP 反應(yīng)把甲基丙烯酸縮水甘油酯接枝到表面，用該手性限進(jìn)材料檢測(cè)并拆分生物樣品中的扁桃酸和氯噻酮。Wang 等[19]在硅膠表面引入十八烷基鏈和芐基氯，通過(guò) SI-ATRP 接枝甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯，水解得到表面含二醇基的反相限進(jìn)材料，用于牛奶中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的分離富集，但接枝十八烷基鏈沒(méi)有采用 SI-ATRP 技術(shù)，以致單體接枝不夠均勻，接枝密度不夠高。
甲基丙烯酸十八烷基酯[20]是具有 18 個(gè)碳的直鏈烷烴，但將其應(yīng)用于限進(jìn)材料的制備未見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)已有將 ATRP 技術(shù)用于制備限進(jìn)材料的文獻(xiàn)，但功能單體接枝量和接枝密度都有待提升。本文通過(guò)二步 SI-ATRP 技術(shù)在硅膠表面接枝兩種不同的功能單體，接枝量高，接枝密度大。新型反相限進(jìn)材料外表面的親水層有效避免樣品基質(zhì)的干擾，對(duì)小分子具有萃取能力，但選擇性不夠高，有待繼續(xù)研究。最后以新型反相限進(jìn)材料為萃取基質(zhì)，結(jié)合HPLC 檢測(cè)牛奶樣品中的土霉素（OTC）。
1 實(shí)驗(yàn)部分。
1.1 儀器、試劑與材料。
LC-20AT 高效液相色譜儀、傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津公司），TU-1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），Vario ELII元素分析儀（德國(guó) Elementar 公司）。
100 ~ 200 目硅膠（青島海洋化工有限公司）；甲基丙烯酸十八烷基酯（純度 96%,含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 01% 的氫醌-甲基醚穩(wěn)定劑）、甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA,純度 97%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（純度 98%）、磺胺二甲氧嘧啶（SDM,純度 99%）、OTC（純度 99%）、CuBr（化學(xué)純）、2,2-聯(lián)吡啶（純度99% ）、2-溴異丁酰溴 （純度 97% ）、牛血清白蛋白（BSA,純度 98%）（上海晶純?cè)噭┯邢薰荆�；濃鹽酸、濃硫酸、異丙醇、甲醇、三乙胺、乙二胺四乙酸二鈉、四氫呋喃、甲苯均為分析純（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；牛奶（購(gòu)于當(dāng)?shù)爻�，寧夏夏進(jìn)乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司）。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2 新型反相限進(jìn)材料的制備過(guò)程。
1.2.1 氨丙基硅膠（Silica-NH2）的制備。
稱取 10. 0 g 硅膠置于 250 mL 圓底燒瓶中，加入 100 mL 20% （體積分?jǐn)?shù)）鹽酸，超聲分散均勻，于110 ℃ 油浴中回流 8 h.水洗至中性，用乙醇和丙酮各洗 3 次，于 120 ℃真空干燥。取 3. 0 g 活化硅膠置于圓底燒瓶中，加 50 mL 無(wú)水甲苯，超聲分散均勻。在 N2保護(hù)下緩慢滴加 5. 20 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，于110 ℃反應(yīng)24 h.用甲苯、丙酮各洗3 次，于 60 ℃ 真空干燥，即得到 Silica-NH2.
1.2.2 2-溴異丁酰溴氨丙基硅膠（Silica-Br）的制備。
冰浴條件下，將 3. 0 g 氨丙基硅膠分散于 30mL 無(wú)水四氫呋喃中，攪拌 1 h,加入 2. 3 mL 三乙胺，再逐滴加入 1. 5 mL 2-溴異丁酰溴，混合物在0 ℃ 下攪拌 30 min,室溫反應(yīng) 24 h.用四氫呋喃、甲醇和水依次洗滌，于 60 ℃真空干燥，即得到 Silica-Br.
1.2.3 釆用 SI-ATRP 在硅膠內(nèi)表面接枝甲基丙烯酸十八烷基酯。
圓底燒瓶中加入 3. 0 g 溴代硅膠作為引發(fā)劑，加入 143 mg CuBr 和 312 mg 2,2-聯(lián)吡啶。另一圓底燒瓶中加 20 mL 無(wú)水甲苯和 20 mL 甲基丙烯酸十八烷基酯，采用真空惰性氣體操作管線裝置，充氮除氧 30 min,在 N2保護(hù)下于 60 ℃反應(yīng) 24 h,分別用異丙醇、二次蒸餾水、0. 2 mol/ L 乙二胺四乙酸二鈉水溶液、水和乙醇洗滌，于 60 ℃真空干燥，即得到Silica-Br-C18.
1.2.4 釆用 SI-ATRP 在硅膠外表面接枝 GMA 鏈。
圓底燒瓶中加入 3. 0 g 接枝 C18的溴代引發(fā)劑硅膠、0. 40 g CuBr 和 1. 28 g 2,2-聯(lián)吡啶。另一圓底燒瓶加入 100 mL 異丙醇和 10 mL GMA,超聲分散均勻。采用真空惰性氣體操作管線裝置，充氮除氧 30 min.在 N2保護(hù)下于 40 ℃反應(yīng) 24 h,通入空氣終止反應(yīng)，依次用異丙醇、甲醇、水、0. 2 mol/ L 乙二胺四乙酸二鈉水溶液、水和丙酮洗滌，于 60 ℃真空干燥，即得到 Silica-Br-C18-GMA.
1.2.5 GMA 鏈水解。
所得產(chǎn)物（Silica-Br-C18-GMA）置于 100 mL 圓底燒瓶中，加入 60 mL 0. 1 mol/ L 硫酸，60 ℃水解12 h,反應(yīng)完畢后，水洗至中性，于 40 ℃ 真空干燥，即得到新型反相限進(jìn)材料（Silica-Br-C18-GMMA）。
1.3 Silica-Br-C18-GMMA 限進(jìn)行為的評(píng)價(jià)。
為體現(xiàn)新型反相限進(jìn)材料的限進(jìn)特點(diǎn)，選擇BSA 作為排阻蛋白質(zhì)大分子模型來(lái)評(píng)價(jià)其外表面的親水性特點(diǎn)。BSA 是相對(duì)分子質(zhì)量約為 68 kDa的疏水性蛋白質(zhì)，經(jīng)常用于模擬生物環(huán)境實(shí)驗(yàn)。選擇結(jié)構(gòu)不同的 SDM 和 OTC 作為小分子模型（見(jiàn)圖1）來(lái)評(píng)價(jià)其內(nèi)表面十八烷基鏈的萃取能力，通過(guò)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)研究該新型反相限進(jìn)材料對(duì)小分子的萃取能力。
1.3.1 Silica-Br-C18-GMMA 對(duì) BSA 的排阻。
在 6 mL 固相萃�。⊿PE）小柱內(nèi)分別填充 200mg Silica-Br-C18-GMMA 和 200 mg Silica-Br-C18,使柱床體積為 2 mL,柱上下兩端用多孔性的聚四氟乙烯篩板，使小柱裝填均勻且空隙較少。裝填完成后，用 1 mL 甲醇和 3 mL 水平衡小柱，注入 3 mL 1g / L BSA 溶液，收集流出液，用紫外分光光度計(jì)在280 nm 處檢測(cè)不保留的 BSA 的吸光度。再用 2mL 水淋洗，用 2 mL 甲醇洗凈小柱。
1. 3. 2 Silica-Br-C18-GMMA 對(duì) SDM 和 OTC 的吸附。
取 20 mg Silica-Br-C18-GMMA 于 50 mL 具塞錐形瓶中，以甲醇為溶劑分別配制一系列不同質(zhì)量濃度的 SDM 和 OTC 溶液，25 ℃下振蕩吸附 12 h,離心，取上清液過(guò) 0. 45 μm 濾膜，用紫外分光光度計(jì)在270 nm 處檢測(cè)溶液中的 SDM,在365 nm 處檢測(cè)溶液中的 OTC,重復(fù)實(shí)驗(yàn) 3 次。根據(jù)吸附前后溶液中質(zhì)量濃度的變化，計(jì)算出該新型反相限進(jìn)材料對(duì) SDM 和 OTC 的平衡吸附量。平衡吸附量按公式（1）計(jì)算：
�。�1）。
其中，Q 為吸附量（mg/ g），Co和 Ce分別為初始濃度和平衡濃度（g/ L），V 為溶液體積（mL），m 為反相限進(jìn)材料的質(zhì)量（g）。
1.4 實(shí)際樣品測(cè)定方法。
1.4.1 樣品處理。
取 10. 0 mL 牛奶樣品置于 50 mL 離心管中，加入一定量 OTC,加 20 mL 乙腈，振蕩混合均勻，超聲20 min,以 4 000 r / min 的速度離心 10 min,上清液過(guò) 0. 22 μm 濾膜，備用。
準(zhǔn)確配制一系列質(zhì)量濃度為 4 ~ 10 mg/ L 的OTC 標(biāo)準(zhǔn)溶液。牛奶樣品中 OTC 加標(biāo)量分別為 3、5 和 9 mg / L,以新型反相限進(jìn)材料作為萃取基質(zhì)對(duì)樣品進(jìn)行分離純化，用 HPLC 檢測(cè)牛奶中 OTC 的含量。
1.4.2 色譜條件。
色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4. 6 mm,5μm）；流動(dòng)相：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 1% 的乙酸銨水溶液-乙腈（87 ∶ 13,v/ v）；檢 測(cè) 波 長(zhǎng)：353 nm;流 速：1mL / min;進(jìn)樣量：20 μL.
2 結(jié)果與討論。
2.1 新型反相限進(jìn)材料的制備。
新型反相限進(jìn)材料采用二步 SI-ATRP 技術(shù)在硅膠內(nèi)外表面分別接枝甲基丙烯酸十八烷基酯和GMA 鏈，合成路線見(jiàn)圖 2.以硅膠為基質(zhì)，表面引入氨基后，與 2-溴異丁酰溴反應(yīng)得到溴代引發(fā)劑硅膠。選擇 CuBr/2,2-聯(lián)吡啶為催化體系，甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 分別為功能單體，分別在無(wú)水甲苯和異丙醇中進(jìn)行二步自由基引發(fā)聚合，水解得到表面含二醇基的一種新型反相限進(jìn)材料。得益于 SI-ATRP 技術(shù)，新型反相限進(jìn)材料的疏水層和親水層接枝均勻，兩種功能單體接枝密度高，提高了對(duì)小分子的萃取能力和排阻蛋白質(zhì)的能力。
2.2 新型反相限進(jìn)材料的表征。
2.2.1 紅外光譜分析。
紅外光譜常用來(lái)鑒定樣品表面所含有的功能基團(tuán)。圖 3 是 Silica-Br、Silica-Br-C18、Silica-Br-C18-GMA 和 Silica-Br-C18-GMMA 的紅外光譜圖。808cm-1為 -C-Br 的伸縮振動(dòng)峰，證實(shí)溴代引發(fā)劑硅膠已制備成功。1 102 cm-1為 -C-O 的伸縮振動(dòng)峰，1 736 cm-1為 -C=O 的伸縮振動(dòng)峰，2 856 cm-1為-CH2的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，2 929 cm-1為 -OH 的伸縮振動(dòng)峰。對(duì)比圖 3 中曲線 b、c 和 a 可看出，-C-O 的伸縮振動(dòng)峰、-C=O 的伸縮振動(dòng)峰和 -CH2的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰增強(qiáng)，說(shuō)明通過(guò)二步 SI-ATRP反應(yīng)，活性自由基 Br·成功引發(fā)單體聚合，使甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 這兩種單體成功接枝到硅膠表面。對(duì)比圖 3 中曲線 c 和 d,-OH 的伸縮振動(dòng)峰也明顯增強(qiáng)，說(shuō)明環(huán)氧基開(kāi)環(huán)成功。
2.2.2 元素分析。
對(duì) Silica-Br、Silica-Br-C18和 Silica-Br-C18-GMMA進(jìn)行元素分析，分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表 1.經(jīng)二步 SI-ATRP反應(yīng)后，Silica-Br-C18-GMMA 與 Silica-Br 相比，C 元素含量由 10. 1% 增至 33. 71%,H 元素含量由 1. 88% 增至 4. 95%,充分說(shuō)明甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 成功接枝到硅膠表面。
2.2.3 熱重分析。
熱重分析是測(cè)定表面修飾聚合物接枝量的重要手段[21],圖 4 是 Silica-Br、Silica-Br-C18和 Silica-Br-C18-GMMA 的熱重分析圖。Silica-Br 在 29 ~ 270 ℃時(shí)失重百分比為 8. 03%,主要由 3-氨基丙基三乙氧基硅烷和 2-溴異丁酰溴的熱分解造成。Silica-Br-C18在 26~260 ℃和 220~800 ℃時(shí)失重百分比分別為 4. 82% 和 28. 20%,與 Silica-Br 相比，失重相對(duì)較大，這是由交聯(lián)劑和接枝到硅膠內(nèi)表面的甲基丙烯酸十八烷基酯的損失造成。Silica-Br-C18-GMMA 在160 ~ 787 ℃ 時(shí)失重最大，失重百分比為 55. 49% ,這主要是甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 鏈的損失所致。由此可證實(shí)兩種單體成功接枝在硅膠表面。
2.3 新型反相限進(jìn)材料分離的富集性能。
2.3.1 Silica-Br-C18-GMMA 對(duì) BSA 的排阻性能。
相同條件下，Silica-Br-C18和 Silica-C18-GMMA的蛋白質(zhì)排阻回收實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表 2.Silica-Br-C18通過(guò) SI-ATRP 反應(yīng)在硅膠表面只接枝 C18烷基鏈，疏水性較強(qiáng)，與 BSA 通過(guò)靜電作用結(jié)合，其結(jié)合BSA 的量為 22. 9%.Silica-C18-GMMA 與 BSA 的結(jié)合量為 12. 4%,低于 Silica-Br-C18,這是因?yàn)樵摬牧贤獗砻娴亩蓟哂杏H水性，對(duì) BSA 具有屏蔽作用，使其不能進(jìn)入內(nèi)表面，說(shuō)明新型反相限進(jìn)材料對(duì)BSA 具有排阻能力。
2.3. 2 Silica-Br-C18-GMMA 材料對(duì) SDM 和 OTC的吸附能力。
以 SDM 和 OTC 作為小分子模型，研究 Silica-Br-C18-GMMA 對(duì)小分子的吸附性能，結(jié)果見(jiàn)圖 5.隨著 SDM 初始濃度的增大，吸附量逐漸增大，當(dāng)濃度大于 0. 9 mmol/ L 后趨于吸附平衡，最大吸附量為 18. 08 mg/ g.隨著 OTC 初始濃度的增大，吸附量逐漸增大，當(dāng)濃度大于 0. 15 mmol/ L 后，吸附量基本保持不變，最大吸附量為 4. 4 mg/ g.Silica-Br-C18-GMMA 材料內(nèi)表面鍵合非極性的十八烷基鏈，與 SDM 和 OTC 的相互作用主要是疏水作用。從二者結(jié)構(gòu)看，OTC 中含有 6 個(gè)羥基，極性大于 SDM,所以 OTC 的疏水作用小于 SDM,故 SDM 的吸附量大于 OTC 的吸附量；從空間位阻看，可能由于限進(jìn)材料外表面具有大量羥基，分子量小的 SDM 更容易進(jìn)入內(nèi)表面與十八烷基鏈產(chǎn)生相互作用。SDM 和OTC 在新型反相限進(jìn)材料上都有一定量的吸附，證明新型反相限進(jìn)材料除了外表面具有親水的二醇基之外，其內(nèi)表面的 C18鏈具有萃取小分子物質(zhì)的能力，體現(xiàn)出新型反相限進(jìn)材料的雙官能團(tuán)特點(diǎn)。
2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定。
用 HPLC 檢測(cè)處理過(guò)的牛奶樣品，結(jié)果未檢測(cè)到 OTC.以新型反相限進(jìn)材料為萃取基質(zhì)，進(jìn)行OTC 加標(biāo)回收試驗(yàn)。
使用新型反相限進(jìn)材料結(jié)合 HPLC 分離富集并檢測(cè)牛奶樣品中的 OTC.圖 6a 為 9 mg/ L OTC 標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖，出峰時(shí)間為 9 min;圖 6b 為牛奶加標(biāo) OTC（9 mg/ L）樣品經(jīng)新型反相限進(jìn)材料處理的液相色譜圖；圖 6c 為牛奶空白樣品。以 OTC 的峰面積 y 對(duì)質(zhì)量濃度 x（mg/ L）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為 y=15. 907x-41 617,相關(guān)系數(shù)為 0. 992 7,表明OTC 在對(duì)應(yīng)的 4 ~ 10 mg / L 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。OTC 的平均加標(biāo)回收率為 89. 19%（n = 3），其 RSD 為 3. 03%.
3 結(jié)論。
本文采用二步 SI-ATRP 技術(shù)將甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 鍵合到硅膠表面，制得新型反相限進(jìn)材料。傅里葉變換紅外光譜分析、元素分析和熱重分析數(shù)據(jù)均表明兩種功能單體接枝成功�？疾煨滦头聪嘞捱M(jìn)材料結(jié)合固相萃取小柱對(duì)蛋白質(zhì)大分子的排阻性能，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)其對(duì)蛋白質(zhì)的排阻效果良好；通過(guò)吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)結(jié)構(gòu)不同的小分子物質(zhì)具有一定的吸附能力，說(shuō)明內(nèi)表面的十八烷基鏈具有萃取能力。該材料作為吸附劑，用于分離富集牛奶樣品中的 OTC,效果良好。該新型反相限進(jìn)材料有望應(yīng)用于含有白蛋白、免疫球蛋白或血纖維蛋白原等大量蛋白質(zhì)的復(fù)雜生物樣品的前處理和藥物小分子的檢測(cè)。
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