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人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準及操作程序
H7N9亞型禽流感病毒是甲型流感中的一種。2013年3月底，在上海和安徽兩地率先發現發現3人感染H7N9禽流感病例。H7N9型禽流感是全球首次發現的新亞型流感病毒，尚未納入我國法定報告傳染病監測報告系統，并且也尚未有疫苗推出。被該病毒感染均在早期出現發熱等癥狀。下面是yjbys小編為大家帶來的人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準及操作程序的知識，歡迎閱讀。
一、目的
確保人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測過程標準化、規范化，降低人為不規范操作對檢測結果造成的影響，保證結果的準確性和可重復性。
二、適用范圍
醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室按照《關于醫院開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測有關工作的通知》(衛辦醫政函〔2013〕383號)和《關于做好醫療機構人感染H7N9禽流感檢測試劑供給保障工作的通知》(衛發明電〔2013〕29號)有關要求，使用國家疾病預防控制中心制備或商品化試劑盒開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測工作。
三、樣本采集、運送和保存
1、盡量采集病例發病早期的呼吸道樣本(上呼吸道樣本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道樣本包括痰液、氣管吸取物、肺洗液、肺組織等)。可將鼻、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高檢出率�；颊哂邢潞粑罉颖緯r，應優先采集。
2、根據試劑說明書對樣本采集方法有關要求，制訂樣本采集標準操作程序(SOP)，并組織樣本采集人員進行培訓及考核。樣本的采集應當嚴格按照SOP進行。
3、樣本采集后，按照《人間傳染病的病原微生物名錄》中高致病性禽流感病毒的相關規定進行包裝，用密封容器立即送往實驗室。若氣溫高時，需放入冰塊降溫。樣本抵達實驗室后，應盡快進行檢測，24小時內能檢測的樣本可置于2～8℃暫時保存，24小時內無法檢測的樣本則應置于≤-70℃狀態保存。如無-70℃保存條件時，可于-20℃冰箱暫存。樣本避免反復凍融。
4、樣本采集、處理、運輸及保存不當時，可因病毒RNA降解出現假陰性結果，也可因為樣本“污染”出現假陽性結果。
四、PCR檢測
(一)樣本處理
樣本的核酸提取應當在樣本處理區進行。按所采用的商品化試劑盒說明書要求，取適量待檢樣本、陽性及陰性對照進行核酸提取。樣本應盡可能新鮮，提取過程應嚴防RNA酶污染及操作不當導致的RNA降解。提取過程如涉及離心步驟，應采用低溫冷凍離心機;在生物安全柜內進行加樣、提取過程中，為防止RNA降解，可將試管架置于托盤內平鋪的碎冰上。提取好的RNA應及時用于檢測，否則應當-70℃保存。如無-70℃保存條件，可于-20℃冰箱暫存。
(二)試劑準備
試劑準備應當在試劑準備區進行。根據所用的試劑盒，樣本可進行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亞型或H7N9病毒核酸的檢測。試劑的配制按所用商品化試劑盒說明書進行。除酶混合物外，其它試劑在使用前應當在室溫充分復融，混勻并瞬時低速離心。反應液分裝時盡量避免產生氣泡，上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免管內溶液泄露污染儀器。分裝有擴增反應液的反應管應當扣蓋或裝入密實袋內再轉移至樣本處理區。
(三)加樣
加樣應當在樣本處理區進行。加樣時應當使樣品完全落入反應液中，不應有樣品粘附于管壁上，加樣后應盡快蓋緊管蓋。
按試劑、儀器說明書完成加樣和PCR反應管準備。
(四)PCR擴增檢測
PCR擴增檢測在擴增區進行。待檢PCR管轉移至擴增區，按順序置于PCR儀上，編輯樣本信息，按試劑和儀器說明書設定循環參數。
(五)結果分析
根據所用試劑盒說明書設置基線值(baseline)。熒光閾值(threshold)設定以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線(無規則的噪音線)的最高點為原則，且Ct值應大于所設置的擴增循環數(或顯示為undet)。使用儀器配套軟件自動分析結果。
(六)質量控制
檢測過程對可能出現的假陽性和假陰性進行質量控制，除了檢測商品試劑盒所提供陽性和陰性對照外，每次臨床樣本檢測時，至少應當有1份弱陽性和3份陰性質控樣本(多份陰性質控樣本設置對實驗室“污染”所致假陽性的監控更為有效)，隨機放在所檢測標本的中間。弱陽性質控樣本可為檢測陽性的滅活稀釋后保存的臨床樣本、滅活病毒或假病毒顆粒等，如所采用的商品化試劑盒有“內標”控制假陰性，或弱陽性質控樣本來源困難，可暫不設弱陽性質控。陰性質控樣本采用標本采集管內溶液即可。質控樣本應與臨床標本同等對待，參與樣本核酸提取和擴增檢測全過程。
試劑盒中的陽性和陰性對照用于判斷實驗室的有效性，按試劑盒說明書進行。
(七)實驗結果的判定與解釋。
按照試劑盒說明書進行。對于出現弱陽性結果的樣本應進行重復檢測，并注意與可能的實驗室輕度或樣本交叉“污染”所致假陽性結果區別。
五、檢測結果報告
按照試劑盒說明書進行。
六、其它注意事項
(一)人感染H7N9禽流感病毒實驗室活動、樣本采集和運輸按照《人間傳染的病原微生物名錄》中高致病性禽流感病毒進行管理。從事人感染禽流感檢測的技術人員必須經過生物安全培訓并具備相應的實驗技能，在檢測過程中必須采取生物安全防護措施(使用眼罩、N95型口罩等)。樣本核酸提取必須在Ⅱ級生物安全實驗室，經過年檢合格的二級生物安全柜內進行。實驗室應具有良好的通風。
(二)注意儀器設備的日常和定期維護，加樣器、擴增儀和溫育設備應進行定期校準。試劑盒及一次性使用的無DNA酶和RNA酶PCR反應管、離心管、帶濾芯吸頭等應進行每批質檢。
(三)實驗應嚴格分區操作;各區物品、工作服等均應當專區專用，不得交叉使用。實驗后應及時清潔工作臺，以防污染。
(四)每批實驗室后，可采取實驗室通風、10%次氯酸鈉溶液擦洗地臺面、紫外照射等措施，消除可能存在的擴增產物氣溶膠污染。
(五)使用中國疾控中心制備試劑開展檢測工作時，可參考相應試劑盒說明書有關要求
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