進(jìn)境美國小麥中小麥矮腥黑穗病菌及其近似種的鑒定
摘要：進(jìn)境美國小麥中常攜帶相當(dāng)數(shù)量的禾本科雜草種子，增加了小麥矮腥黑穗病菌同屬腥黑粉菌的傳入風(fēng)險。本文根據(jù)近年來我國口岸在進(jìn)境貨物中截獲到的腥黑粉菌種類以及在進(jìn)境美國小麥中截獲到的雜草種子種類，總結(jié)了進(jìn)境美國小麥可能攜帶的腥黑粉菌種類，篩選出4種小麥矮腥黑穗病菌的近似種，并從冬孢子形態(tài)、自發(fā)熒光、萌發(fā)生理等方面提供了鑒定依據(jù)。
關(guān)鍵詞：進(jìn)境美國小麥;檢疫鑒定;小麥矮腥黑穗病菌
美國是世界主要的小麥輸出國，隨著美國小麥的進(jìn)口，有害生物傳入我國的風(fēng)險也逐漸增大。其中小麥矮腥黑穗病菌(Tilletia contraversa Kuhn，TCK)是進(jìn)境美國小麥檢疫中最為關(guān)注的一種檢疫性有害生物，許多國家都將其列為禁止進(jìn)境檢疫有害生物。它嚴(yán)重為害小麥?zhǔn)蛊浒l(fā)生矮腥黑穗病(TCK病)，該病是世界性檢疫性病害，使受害小麥植株矮小且分蘗多而不結(jié)實(shí)，造成大面積減產(chǎn)，嚴(yán)重時可使小麥減產(chǎn)50%以上，甚至絕收，并且其冬孢子有很強(qiáng)的抗逆性，隨耕種數(shù)以千萬計(jì)的菌癭存活于不同深度的土層中，會累積形成相當(dāng)高的土壤帶菌率，因而極難防治。在實(shí)際檢疫過程中發(fā)現(xiàn)進(jìn)境美國小麥中常帶有雀麥、黑麥草、早熟禾等其他禾本科種子，而這些種類種子是小麥矮腥黑穗病菌近似種小麥網(wǎng)腥黑穗病菌T.caries、雀麥腥黑穗病菌T.bromi、禾草腥黑穗病菌T.fusca等病原菌的寄主，而小麥矮腥黑穗病菌與這些同屬腥黑粉菌近似種的形態(tài)特征相似，在檢疫過程中易造成誤判。
本文整理了近年來我國口岸在進(jìn)境貨物中截獲到的腥黑粉菌種類以及在進(jìn)境美國小麥中截獲到的雜草種子種類，總結(jié)出進(jìn)境美國小麥可能攜帶的腥黑粉菌種類，篩選出小麥矮腥黑穗病菌的近似種，并給出小麥矮腥黑穗病菌與其近似種的鑒定方法，以期為進(jìn)境美國小麥中小麥矮腥黑穗病菌與其近似種的鑒定提供依據(jù)。
一、我國進(jìn)境美國小麥可能攜帶的腥黑粉菌
查詢動植物檢疫信息資源共享服務(wù)平臺，截至2015年6月，我國進(jìn)境貨物中腥黑粉菌的檢出情況見表1：
表1所示，歷年來我國口岸截獲到的腥黑粉屬真菌共12種，其中10種是在美國進(jìn)境的貨物中截獲，其中除了美國大豆外，其他檢出腥黑粉菌的貨物均為小麥及其他禾本科植物種子。而腥黑粉菌的寄主正是禾本科植物，其孢子堆主要生在禾本科植物子房中，也可生在葉、葉鞘和莖上。而在美國大豆的檢疫中時常發(fā)現(xiàn)攜帶有玉米、小麥、雀麥等禾本科植物種子，因此，在美國大豆中截獲的腥黑粉菌極有可能是寄生在這些禾本科種子中。
此外，查詢動植物檢疫信息資源共享服務(wù)平臺，截至2015年6月，我國進(jìn)境美國小麥中截獲的雜草種子共計(jì)484種屬，其中燕麥屬、雀麥屬、稗屬、黑麥草屬等禾本科植物種子共計(jì)100種屬。而檢出腥黑粉菌的進(jìn)境美國貨物高羊茅種子、大豆、黑麥草種子、草地早熟禾草籽、高粱、狗牙根種子、米糠(稻)、多花黑麥草種子在進(jìn)境美國小麥中均有截獲。綜合我國口岸腥黑粉菌的檢出情況及進(jìn)境美國小麥中腥黑粉菌寄主的截獲情況，我國進(jìn)境美國小麥中可能攜帶的腥黑粉菌有T. barclayana、T. bromi、T. caries、TCK、T. foetida、T. fusca、T. hordei、T. horrid、T. walkeri、T. vankyi。
雖然未在進(jìn)境美國貨物中檢出T. ehrhartae和TIM，但有文獻(xiàn)報道1996年在美國亞利桑那州的硬粒小麥上發(fā)現(xiàn)了TIM，2001年，美國又相繼在德克薩斯州的4個縣發(fā)現(xiàn)此病菌，并且常熟檢驗(yàn)檢疫局從進(jìn)境船舶食品艙的美國面粉中截獲到了此病菌。而已有的資料表明僅在南非和澳大利亞的皺稃草屬上報道發(fā)現(xiàn)T. ehrhartae。因此，進(jìn)境美國小麥中檢出T. ehrhartae的可能性小，檢出TIM的可能性大。
綜上，我國進(jìn)境美國小麥中可能攜帶的腥黑粉菌共計(jì)11種，分別為T. barclayana、T. bromi、T. caries、TCK、T. foetida、T. fusca、T. hordei、T. horrid、T. walkeri、T. vankyi、TIM。
二、我國進(jìn)境美國小麥中小麥矮腥黑穗病菌及其近似種的檢疫鑒定
在我國進(jìn)境美國小麥中可能攜帶的11種腥黑粉菌中，TIM直徑24μm-47μm(ave.35.5μm)與T. barclayana、T. horrid、T. walkeri在形態(tài)學(xué)上較為相似，其冬孢子表面結(jié)構(gòu)具有疣狀突起或刺狀結(jié)構(gòu)，孢子大小也非常接近，這幾種腥黑粉菌冬孢子的大小顯著地大于TCK。而T. foetida冬孢子表面光滑，與TCK表面具網(wǎng)狀飾紋的冬孢子易區(qū)別。這幾種腥黑粉菌在檢疫鑒定中均不易與TCK混淆。而T. hordei被認(rèn)為是TCK的`同種異名。TCK與T. bromi、T. caries、T. fusca、T. vankyi 5種腥黑粉菌的冬孢子形態(tài)、激發(fā)濾光片485nm，屏障濾光片520nm下自發(fā)熒光及萌發(fā)生理特性的比較，見表2。
如表2所示，5種腥黑粉菌的冬孢子形態(tài)非常相似，其中T.caries冬孢子顏色較深，網(wǎng)脊較低，網(wǎng)目小，網(wǎng)目數(shù)多，膠質(zhì)鞘薄且不明顯，其余4種腥黑粉菌的冬孢子網(wǎng)脊高，網(wǎng)目大，網(wǎng)目數(shù)少，膠質(zhì)鞘厚且明顯。從萌發(fā)生理看，5種腥黑粉菌的冬孢子的萌發(fā)溫度上存在一定交叉，TCK適宜溫度最低為5℃，其余4種腥黑粉菌冬孢子的萌發(fā)溫度范圍廣，15℃～20℃仍能萌發(fā)。T.vankyi與其余4種腥黑粉菌最顯著的區(qū)別是冬孢子間無融合現(xiàn)象(“H”結(jié))，而在TCK與T. bromi、T. caries、T. fusca中卻普遍存在。
腥黑粉菌屬真菌分類的主要依據(jù)是形態(tài)學(xué)、萌發(fā)生理、細(xì)胞學(xué)等方面的特性以及寄主�；�。但在實(shí)際檢驗(yàn)檢疫過程中，腥黑粉菌屬冬孢子的萌發(fā)培養(yǎng)需要很長時間，若冬孢子休眠，萌發(fā)量又少，則可能出現(xiàn)冬孢子不萌發(fā)的情況，無法在短時間內(nèi)鑒定到種。因此，現(xiàn)在有許多研究以分子生物學(xué)方法來快速鑒定腥黑粉菌，上海檢驗(yàn)檢疫局利用ITS 和mtDNA 序列對進(jìn)境美國小麥中截獲的單個腥黑粉菌冬孢子進(jìn)行擴(kuò)增檢測，鑒定了進(jìn)境美國小麥樣品中的腥黑粉菌為T. walkeir，并利用ITS區(qū)序列和特異性引物PCR分別對進(jìn)境麥稈中截獲的單個腥黑菌冬孢子進(jìn)行擴(kuò)增檢測，鑒定進(jìn)境麥稈中的腥黑粉菌為TIM。但TCK及其近似種的冬孢子直徑平均要比TIM小10μm左右，挑取更為困難，天津檢驗(yàn)檢疫局改進(jìn)冬孢子破碎的方法，建立了雀麥上T. bromi的菌絲基因組DNA的特異PCR檢測方法和冬孢子的套式特異PCR 檢測方法，并利用ITS、IGS等基因序列信息，鑒定了美國紫羊茅、澳大利亞多年生黑麥草和德國多年生黑麥草中攜帶的T.vankyi。為TCK近似種的檢疫鑒定提供了快速、可靠的檢測方法。
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